Прижизненное микроскопия Селезенка: Количественный анализ паразитов Мобильность и кровотока
Summary
Мы покажем, метод для выполнения прижизненной микроскопии селезенки использования GFP трансгенные малярийных паразитов и количественной оценки подвижности паразита и приток крови в этом органе.
Abstract
Появлением прижизненной микроскопии в экспериментальных моделях малярии грызунов позволило значительный прогресс в знании паразит-хозяин 1,2 взаимодействий. Таким образом, в естественных изображений малярийных паразитов во время пре-эритроцитарных этапы выявили активный вход паразитов в кожу лимфатических узлов 3, полного развития паразита в коже 4, и формирование гепатоцитов полученных merosome для обеспечения миграции и выпуск мерозоиты в кровь 5. Более того, развитие отдельных паразитов в эритроцитах был недавно документально использованием 4D визуализации и бросил вызов нашим текущим видом на белок экспорта в борьбе с малярией 6. Таким образом, прижизненных изображений радикально изменила наш взгляд на ключевые события в развитии Plasmodium. К сожалению, исследования динамических прохождения малярийных паразитов через селезенку, основных лимфоидных органов изысканно адаптированы, чтобы очистить зараженный красный бlood клеткам не хватает из-за технических ограничений.
Использование мышиной модели малярии Plasmodium yoelii в BALB / C мышей, мы внедрили прижизненной визуализации селезенки и сообщил дифференциальных реконструкции оно и соблюдение зараженных эритроцитов (pRBCs), чтобы барьер клетки фибробластов происхождения в красной пульпе при инфекции нелетального паразита линии P.yoelii 17X, в отличие от инфекций с P.yoelii 17XL смертельным паразитом строке 7. Для достижения этих выводов специальной методологии использования ImageJ свободного программного обеспечения был разработан, с тем характеристику быстрой трехмерной движение одного pRBCs. Результаты, полученные с этим протоколом позволяют определить скорость, направленность и время пребывания паразитов в селезенке, все параметры решения соблюдение в естественных условиях. Кроме того, мы сообщаем методология количественного кровотока использовании прижизненной микроскопии и использованием DIFразличным красители, чтобы разобраться в сложной структуре микроциркуляторного из селезенки.
Этика заявление
Все исследования на животных были проведены на животных объектах университета Барселоны в соответствии с руководящими принципами и протоколов утвержденным Комитетом по этике защиты животных эксперименты в Университете Барселоны CEEA-UB (Протокол № DMAH: 5429). Женский BALB / C мышей 6-8 недельного возраста были получены из Charles River Laboratories.
Protocol
Discussion
Реализация прижизненной микроскопии селезенки в этой модели малярии грызунов открыл возможность исследовать динамическое прохождение паразитов через этот орган, который до сих пор считается "черный ящик" из-за технических соображений. В здесь, основные усилия были поставлены н?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы особенно благодарны С. Graewe и В. Heussler для начальной подготовки и непрерывного ввода в прижизненной микроскопии малярийных паразитов, чтобы Бернс за благотворительный взнос GFP трансгенные паразитов, А. Bosch (конфокальной Unit, CCIT-UB, IDIBAPS) за помощь в анализе изображений и количественной оценки и П. Astola для оказания технической помощи. Мы благодарим Р. Tous и И. Caralt для видео производства. MF является получателем стипендий от Общность Каталонии. Компенсации является профессором ICREA исследований. Работа в лаборатории о компенсации финансируется Седьмой рамочной Европейского Сообщества Наций (FP7/2007-2013) в рамках грантового соглашения N ° 242095, в частный фонд Селлекс (Каталония, Испания), а также испанского министерства по науке и инновациям ( SAF2009-07760).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites–recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. v. a. n. d. e. r., R, . A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. . The complete spleen. , (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
