비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석
Summary
우리는 GFP 형질 전환 말라리아 기생충이 장기 내에 기생충의 이동성과 혈액 흐름의 부량를 사용하여 비장의 intravital 현미경을 수행하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
실험 쥐 모델에서 말라리아 intravital 현미경의 도래가 기생충 – 호스트 상호 작용의 1,2의 지식에 큰 발전을 허용하고 있습니다. 따라서, 사전 erythrocytic 단계 동안 말라리아 기생충의 생체내 이미징의 피부 림프절 3, 피부 4 기생충의 완전한 개발 및 마이 그 레이션을 보장하기 위해 hepatocyte – 파생 merosome의 형성에 기생충의 활성 입구를 밝혀하고있다 혈액 흐름 5로 merozoites의 릴리스. 또한 적혈구에서 개별 기생충의 개발은 최근 4D 영상을 사용하여 문서화하고 말라리아 6 단백질 수출에서 현재보기를 도전했습니다. 따라서 intravital 이미징은 크게 Plasmodium 개발의 주요 행사에 대한 우리의 견해를 변경했습니다. 불행히도, 비장, 주요 림프 기관을 통해 말라리아 기생충의 동적 통과 연구 정교하게 감염 빨간색 B 선택을 취소 적응lood 전지 기술 제약으로 인해 부족입니다.
Balb / C 마우스에서 말라리아 Plasmodium yoelii의 murine 모델을 사용하여, 우리는 비장의 intravital 이미지를 구현하고 동안 붉은 과육에 fibroblastic 원산지 장벽 세포에 차동 그것의 리모델링과 parasitized 적혈구의 준수 (pRBCs)를보고 비 치명적인 기생충 라인 P.yoelii 17X와 감염으로 P.yoelii 17XL 치명적인 기생충 라인 7 감염 반대. 이러한 결론에 도달하려면, ImageJ 무료 소프트웨어를 사용하여 특정 방법론은 단일 pRBCs의 빠른 입체 운동의 특성을 활성화하기 위해 개발되었습니다. 이 프로토콜로 얻은 결과는 비장의 기생충의 속도, 방향 및 체류 시간을 결정하는 허용, 모든 매개 변수는 생체내에 부착을 해결. 또한, 우리는 혈액 흐름 intravital 현미경을 사용하여 부량와 DIF의 사용에 대한 방법론을보고ferent 비장의 복잡한 microcirculatory 구조에 대한 통찰력을 얻기 위해 에이전트를 착색.
윤리 진술
모든 동물 연구 바르셀로나 CEEA – UB (5429 프로토콜 없음 DMAH) 대학의 동물 실험에 대한 윤리위원회의 승인 지침과 프로토콜에 따라 바르셀로나 대학의 동물 시설에서 실시되었다. 연령 6-8 주 여성 Balb / C 생쥐는 찰스 리버 연구소에서 얻은했다.
Protocol
Discussion
이 쥐 말라리아 모델에서 비장의 intravital 현미경의 구현은 지금까지 기술적인 고려 사항에 "블랙 박스"로 인해 간주되어이 기관을 통해 기생충의 역동적인 통로를 조사 가능성을 열었습니다. 여기에서는 주요 노력은 단일 및 인구 수준에서 다른 기생충 라인의 비교 분석을 허용하는 양적 방법을 적응 넣어되었습니다. 말라리아 3,5 년 전에 이미지 있었다 다른 조직과 세포와는 달?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 A. 보쉬 (공촛점 단위, CCiT – UB, IDIBAPS)에, GFP 형질 전환 기생충을 기부에 대한 J. 화상에, 말라리아 기생충의 intravital 현미경의 초기 교육 및 지속적인 입력을위한 S. Graewe 및 V. Heussler 특히 감사 이미지 분석 및 기술 지원 부량 및 P. Astola에 도움. 우리는 R.의 Tous 및 비디오 제작을위한 I.의 Caralt 감사합니다. MF는 카탈로니아의 일반에서 졸업 교제의 수상자이다. 우연은 ICREA 연구 교수이다. 우연의 연구실에서 작업이 부여 계약 N에서 유럽 공동체의 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013) · 242,095, 사립 설립 연도 CELLEX (카탈로니아, 스페인)에 의해 의해 과학 및 혁신의 스페인 교육부 (재정 지원입니다 SAF2009 – 07760).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites–recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. v. a. n. d. e. r., R, . A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. . The complete spleen. , (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
