Summary

Spectral konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Nikotinrezeptoren in Knock-in Mäusen mit chronischer Gabe von Nikotin

Published: February 10, 2012
doi:

Summary

Wir haben eine neue Technik zur Quantifizierung nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors Veränderungen innerhalb subzellulären Regionen spezifischen Subtypen von ZNS-Neuronen zum besseren Verständnis der Mechanismen der Nikotinabhängigkeit, indem eine Kombination von Ansätzen einschließlich fluoreszierendes Protein Markierung des Rezeptors mit dem Knock-in-Ansatz entwickelt und spektrale konfokale Bildgebung.

Abstract

Liganden-gesteuerte Ionenkanäle im zentralen Nervensystem (ZNS) werden in zahlreichen Bedingungen mit schweren medizinischen und sozialen Folgen verwickelt. So ist zum Beispiel Sucht nach Nikotin über das Rauchen eine der häufigsten Ursachen für vorzeitigen Tod weltweit (World Health Organization) und wird wahrscheinlich durch eine Veränderung der Ionenkanal-Verteilung im Gehirn 1 verursacht. Chronische Nikotin bei Nagern und Menschen führt zu einer erhöhten Anzahl von nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) im Hirngewebe 1-3. Ebenso haben Veränderungen in den glutamatergen GluN1 oder GluA1 Kanäle bei der Auslösung von Sensibilisierung mit anderen süchtig machenden Drogen wie Kokain, Amphetamine und Opiate 4-6 in Verbindung gebracht.

Folglich ist die Fähigkeit zu erfassen und zu quantifizieren, Verteilung und Expressionsmuster von spezifischen Ionenkanäle von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Mechanismen der Sucht. Das Studium der Hirnregion-spezifische efgen von einzelnen Drogen wurde durch das Aufkommen von Techniken wie der radioaktiven Liganden vorangetrieben. Jedoch verhindert die geringe räumliche Auflösung des radioaktiven Liganden-Bindung in der Lage, Liganden-gesteuerte Ionenkanäle in spezifischen Subtypen von Neuronen zu quantifizieren.

Genetisch kodierte fluoreszierende Reporter, wie grün fluoreszierende Protein (GFP) und seine vielen Farbvarianten, revolutioniert haben das Feld der Biologie 7. Durch gentechnisch Tagging einen fluoreszierenden Reporter an ein endogenes Protein ein Protein in vivo 10.07 visualisieren können. Ein Vorteil der Fluoreszenz-Tagging Proteine ​​mit einer Sonde ist die Beseitigung von Antikörper Verwendung, die Probleme der Nichtspezifizität und Zugänglichkeit an das Zielprotein aufweisen. Wir haben diese Strategie, um Fluoreszenz-Label nAChRs, das die Studie von Rezeptor-Montage mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET) in transfizierten Kulturzellen 11 aktiviert werden. In jüngerer Zeit haben wir die knoc verwendetk-Ingenieur in Annäherung an Mäusen, die mit gelb fluoreszierenden Protein markiert α4 nAChR-Untereinheiten (α4YFP), ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Rezeptor ex vivo bei Sub-Mikrometer-Auflösung in ZNS-Neuronen über spektrale konfokale Mikroskopie 12. Die gezielte fluoreszierende Knock-in-Mutation befindet sich im endogenen Locus und unter Kontrolle seines nativen Promotors eingebaut, wodurch ein normales Niveau der Expression und Regulation des Rezeptors, wenn um den unmarkierten Rezeptoren in Wildtyp-Mäusen verglichen. Das Knock-in-Ansatz kann erweitert werden, fluoreszierend markieren andere Ionenkanäle werden und bietet eine leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von Rezeptoren im ZNS.

In diesem Beitrag beschreiben wir eine Methode, um Veränderungen in der nAChR-Expression in spezifischen ZNS-Neuronen nach der Exposition mit chronischem Nikotin zu quantifizieren. Unsere Methoden sind mini-osmotischen Pumpe Implantation, intrakardiale Perfusionsfixierung, Abbildung und Analyse von fluoreszenzmarkierten Nikotinsäure receptor Untereinheiten aus α4YFP knock-in Mäuse (Abb. 1). Wir haben die Verfahren zur Fixierung optimiert, um Autofluoreszenz von festen Gehirn tissue.We minimieren beschreiben im Detail unsere Methode Bildgebung unter Verwendung einer spektralen konfokalen Mikroskop in Verbindung mit einem linearen Entmischung Algorithmus autofluoresent Signal zu subtrahieren, um genau zu erhalten α4YFP Fluoreszenzsignals. Schließlich zeigen wir Ergebnisse von chronischem Nikotin-induzierte Hochregulation von α4YFP Rezeptoren im medialen perforans des Hippocampus.

Protocol

1. Pump Implantation Vor der Implantation Pumpe, füllen und bereitet die Alzet mini-osmotischen Pumpen (Alzet, Modell 2002, Cupertino, USA) man aufpassen, nicht, um Luftblasen zu präsentieren. Dieses Modell der Mini-osmotische Pumpe liefert Lösung bei einer Rate von 0,5 ul / h für 14 Tage. Stellen Sie sicher, sterilen Bedingungen. Wiegen Sie leeren und gefüllten Pumpen. Am Ende des Experiments (10 Tage nach der Implantation), kann die verbleibende Flüssigkeit in der Pumpe mit einer Spritze und Nadel ent…

Discussion

<p class="jove_content"> Verwendung einer fluoreszierenden Rezeptors in einer Knock-in Mausmodell Menge und Lokalisierung eines bestimmten Ions Kanal zu bestimmen bietet eine Reihe von Vorteilen. Im Gegensatz zu Proteinen wie Aktin, das ubiquitär in allen Zellen exprimiert wird, sind die Ionenkanäle in weit geringerer Anzahl vorhanden und ihre Expression variiert zwischen neuronaler Subtypen machen eine genaue Analyse über traditionelle immunhistochemischen Techniken eine Herausforderung. Die α4YFP Genprodukt wird in WT Ebenen zum Ausdru…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Anthony Renda wurde von einem University of Victoria Graduate Fellowship Award unterstützt. Myre und Winifred Sim Fund, einer kanadischen Stiftung für Innovation Finanzhilfe, wird British Columbia Knowledge Development Fund – Diese Arbeit wurde von einem Natural Sciences and Engineering Research Council von Kanada Discovery Grant, ein NARSAD Young Investigator Award (bis RN), eine Victoria-Stiftung unterstützt und ein Natural Sciences and Engineering Research Council von Kanada Research Tools und Instrumentation Grant. Wir danken Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald und Daniel Morgado für exzellente Maus Tierhaltung.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
mini-osmotic pumps Alzet model 2002  
saline Teknova S5819  
(-)-nicotine hydrogen tartrate salt Sigma N5260  
eye drops Novartis Tear-Gel  
Vetbond glue 3M 1469SB  
heparin sodium salt Sigma H4784  
10x PBS Invitrogen 70011  
ketamine Wyeth Animal Health 0856-4403-01  
medatomidine hydrochloride Pfizer 1950673  
23G butterfly needle Becton Dickinson 367253  
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710  
plastic embedding mold VWR 18986-1  
O.C.T. Mounting Compound Tissue-Tek 4583  
Mowiol 4-88 EMD-Calbiochem 475904 pH 8.5

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Cite This Article
Renda, A., Nashmi, R. Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration. J. Vis. Exp. (60), e3516, doi:10.3791/3516 (2012).

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