דימות ספקטרלי Confocal של קולטנים ניאציניות מתויג fluorescently ב עקום בעכברים עם מינהל ניקוטין כרונית
Summary
פיתחנו שיטה חדשנית של לכימות ניאציניות קולטני אצטילכולין שינויים בתוך אזורים subcellular של תת ספציפיים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית כדי להבין טוב יותר את המנגנונים של התמכרות לניקוטין באמצעות שילוב של גישות כולל תיוג חלבון פלואורסצנטי של הקולטן באמצעות עקום בגישה רפאים confocal הדמיה.
Abstract
ליגנד-מגודרת תעלות יונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) הם מעורבים תנאים רבים עם השלכות רפואיות וחברתיות קשות. למשל, התמכרות לניקוטין באמצעות עישון טבק הוא הגורם המוביל למוות בטרם עת ברחבי העולם (ארגון הבריאות העולמי) והיא נגרמת ככל הנראה על ידי שינוי של חלוקת ערוץ יונים במוח 1. חשיפה כרונית לניקוטין בשני מכרסמים ותוצאות בני אדם מספרים מוגברת של קולטני אצטילכולין ניאציניות (nAChRs) ברקמת המוח 1-3. כמו כן, שינויים או את GluN1 GluA1 ערוצי glutamatergic היו מעורבים לעורר רגישות לסמים ממכרים אחרים כגון קוקאין, אמפטמינים ו 4-6 בסמי הרגעה.
כתוצאה מכך, היכולת למפות ולכמת הפצה ביטוי דפוסים של תעלות יונים מסוימות חשוב ביותר להבנת המנגנונים של התמכרות. מחקר של אזור ספציפי במוח EFfects של תרופות בודדות קידם כניסתו של טכניקות כגון ligands רדיואקטיביים. עם זאת, ברזולוציה מרחבית נמוכה מחייב ליגנד רדיואקטיבי מונע את היכולת לכמת ליגנד-מגודרת תעלות יונים של תת ספציפיים של נוירונים.
כתבים ניאון מקודדים גנטית, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו גרסאות רבות שלה צבע, חוללו מהפכה בתחום הביולוגיה 7. על ידי תיוג גנטית כתב ניאון לחלבון אנדוגני אפשר לדמיין חלבונים in vivo 7-10. אחד היתרונות של fluorescently תיוג חלבונים עם החללית היא חיסול השימוש נוגדנים, אשר יש בעיות של nonspecificity ונגישות חלבון המטרה. השתמשנו באסטרטגיה זו כדי fluorescently nAChRs תווית, אשר אפשרו את לימוד מכלול הקולטן באמצעות פורסטר תהודה העברת אנרגיה (סריג) בתאים בתרבית transfected 11. לאחרונה, השתמשנו knocK-בגישה לעכברים מהנדס עם חלבון פלואורסצנטי צהוב מתויג α4 יחידות משנה nAChR (α4YFP), המאפשר כימות מדויק של vivo הקולטן לשעבר ברזולוציה submicrometer בנוירונים במערכת העצבים המרכזית באמצעות מיקרוסקופיה confocal רפאים 12. ממוקד ניאון עקום של מוטציה משולב לוקוס אנדוגני תחת שליטה של האמרגן המקורית שלו, לייצר רמות נורמליות של ביטוי וויסות של הקולטן בהשוואה קולטנים לא מתויגות בעכברים wildtype. גישה זו דפיקה-in ניתן להרחיב fluorescently לתייג תעלות יונים אחרים ומציע גישה חזקה של הדמיה לכימות קולטני מערכת העצבים המרכזית.
במאמר זה אנו מתארים מתודולוגיה לכמת שינויים בביטוי nAChR בנוירונים מסוימים במערכת העצבים המרכזית לאחר החשיפה לניקוטין כרונית. השיטות שלנו כוללות מיני האוסמוטי השתלת המשאבה, קיבעון זלוף intracardiac, הדמיה וניתוח של rec ניקוטינית מתויג fluorescentlyeptor יחידות משנה של α4YFP עקום בעכברים (איור 1). יש לנו אופטימיזציה הטכניקה קיבעון למזער autofluorescence מ tissue.We המוח קבועה תאור מפורט של המתודולוגיה שלנו דימות באמצעות מיקרוסקופ confocal רפאים יחד עם אלגוריתם unmixing ליניארי רפאים כדי להחסיר אות autofluoresent כדי להשיג דיוק האות הקרינה α4YFP. לבסוף, אנו מראים תוצאות upregulation ניקוטין הנגרמת כרונית של קולטני α4YFP בנתיב perforant המדיאלי של ההיפוקמפוס.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנתוני Renda נתמך על ידי אוניברסיטת פרס ויקטוריה מלגה לתואר שני. מחקר זה נתמך על ידי למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה דיסקברי גרנט, פרס NARSAD לחוקר הצעיר (עד RN), קרן ויקטוריה – Myre ו ויניפרד סים הקרן, הקרן הקנדית חדשנות גרנט, פיתוח קולומביה הבריטית קרן ידע ואת למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של כלי קנדה מחקר ו גרנט מכשור. אנו מודים Jillian מקיי, כריסטינה בארנס, אריאל סאליבן, ג'ניפר מקדונלד ודניאל Morgado עבור בעלי העכבר מעולה.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| mini-osmotic pumps | Alzet | model 2002 | |
| saline | Teknova | S5819 | |
| (-)-nicotine hydrogen tartrate salt | Sigma | N5260 | |
| eye drops | Novartis | Tear-Gel | |
| Vetbond glue | 3M | 1469SB | |
| heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
| 10x PBS | Invitrogen | 70011 | |
| ketamine | Wyeth Animal Health | 0856-4403-01 | |
| medatomidine hydrochloride | Pfizer | 1950673 | |
| 23G butterfly needle | Becton Dickinson | 367253 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| plastic embedding mold | VWR | 18986-1 | |
| O.C.T. Mounting Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Mowiol 4-88 | EMD-Calbiochem | 475904 | pH 8.5 |
References
- Perry, D. C., Davila-Garcia, M. I., Stockmeier, C. A., Kellar, K. J. Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-1552 (1999).
- Schwartz, R. D., Kellar, K. J. Nicotinic cholinergic receptor binding sites in the brain: regulation in vivo. Science. 220, 214-216 (1983).
- Marks, M. J., Burch, J. B., Collins, A. C. Effects of chronic nicotine infusion on tolerance development and nicotinic receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 226, 817-8125 (1983).
- Carlezon, W. A. J., Nestler, E. J. Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse. Trends Neurosci. 25, 610-615 (2002).
- Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., Nestler, E. J. Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents. J. Neurosci. 16, 274-2782 (1996).
- Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., Malenka, R. C. Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons. Neuron. 37, 577-5782 (2003).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Nashmi, R., Dickinson, M. E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S. E. Assembly of α4β2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J. Neurosci. 23, 11554-11567 (2003).
- Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S. R., Whiteaker, P. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional α4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Dickinson, M. E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., Fraser, S. E. Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy. BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).
- Nashmi, R., Fraser, S. E., Lester, H., Dickinson, M. E., Periasamy, A., Day, R. N. . Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy. , 180-192 (2005).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Larson, J. M. The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed. Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).
- Melvin, N. R., Sutherland, R. J. Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs. J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).
- Jones, I. W., Wonnacott, S. Why doesn’t nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out. Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).
- Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures. J. Neurochem. , (2007).
- Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression. The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).
- Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).
- Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment. Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).
- King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration. Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).
- Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine. Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).
- Sparks, J. A., Pauly, J. R. Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice. Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).
- Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study. 신경과학. 129, 415-4124 (2004).
- Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391, 173-177 (1998).
- Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake. Nature. 471, 597-601 (2011).
- Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436, 103-107 (2005).
- Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research. Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).
- Lang, T., Rizzoli, S. O. Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures. Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).
