Summary

Murine Oppervlakkige lymfkliertest Chirurgie

Published: May 21, 2012
doi:

Summary

Om de progressie van een immuunrespons na verloop van tijd in dezelfde muis volgen, kunnen de lymfeklieren achter elkaar worden verwijderd door een operatie. Hier wordt beschreven hoe deze techniek kan worden uitgevoerd.

Abstract

Op het gebied van de immunologie, om de progressie van een immuunrespons tegen een vaccin, een infectie of tumor te begrijpen wordt de reactie vaak tijd te volgen. Ook de studie van lymfocyten homeostase vergt tijd natuurlijk experimenten. Het uitvoeren van deze studies in dezelfde muis is ideaal om de experimentele variabiliteit en het aantal muizen gebruikt verminderen. Blood terugtrekking kan uitvoeren van tijdsverloop experimenten maar geeft slechts over circulerende lymfocyten en geeft een beperkt aantal cellen 1-4. Sinds lymfocyten circuleren door het lichaam en die woonachtig zijn in de lymfeklieren hebben verschillende eigenschappen, is het belangrijk om te onderzoeken beide locaties. De sequentiële verwijdering van lymfeklieren door een operatie biedt een unieke gelegenheid om een ​​immuunrespons of immuun cel expansie in dezelfde muis over de tijd te volgen. De techniek levert tussen 1 2×10 6 cellen per lymfeknoop die voldoende is om ierform fenotypische karakterisering en / of functionele assays. Sequential lymfklier operatie of lymfadenectomie is met succes gebruikt door ons en anderen 5-11. Hier beschrijven we hoe de arm en lies lymfeklieren kan worden verwijderd door een kleine incisie in de huid van een narcose muis. Sinds de operatie is oppervlakkig en snel gedaan, de muis herstelt heel snel geneest goed en niet een overmatige pijn. Elke tweede dag, is het mogelijk om oogsten een of twee lymfeknopen waardoor tijdsverloop experimenten. Deze techniek is dus geschikt om de eigenschappen van lymfeknoop-verblijvende lymfocyten bestuderen tijd. Deze aanpak is geschikt voor verschillende experimentele ontwerpen en wij geloven dat veel laboratoria baat zouden hebben bij het uitvoeren van opeenvolgende lymfeknoop operaties.

Protocol

1. Voorbereiding voor de operatie Muizen werden behandeld in overeenstemming met de Canadese Raad voor Dierenaangelegenheden Care richtlijnen. Verdoven muizen door injectie van ketamine / xylazine (150/300 mg / kg, ip) of door inhalatie van isofluraan (2% 1L zuurstof). Indien beschikbaar is, dient isofluraan worden gebruikt als het zorgt voor een betere controle van de narcose tijd en diepte. Ook is zuurstof toegediend op hetzelfde moment waarop de fysiologische functies van het d…

Discussion

We hebben beschreven een protocol van LN operatie die kan worden toegepast op een groot aantal experimentele systemen. Hoewel het zeer nuttig om te volgen immuunreacties of immuuncellen homeostase, deze techniek heeft een aantal beperkingen. Ten eerste kan slechts vier LNS worden geoogst. Ten tweede moet de bestudeerde immuunrespons zijn systemische of voorkomen in de oppervlakkige inguinale of brachiale (huid-drainage) LNS. Tenslotte wordt het aantal geoogste cellen beïnvloed door de kwaliteit van de LN verwijdering, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Sylvie Lesage en alle lab-leden voor de kritische lezing van het protocol. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​(MOP-77545) van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque wordt ondersteund door een FRSQ Senior Scholarship en Melissa Mathieu kreeg een NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship.

Materials

Reagent Name Company Catalog number Comments
Graefe Fine Pattern Premium Forceps Harvard Apparatus 52-2144 Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip
Michel Clip Applying and Removing Forceps Harvard Apparatus 52-3779 12.5 cm (5 in)
Michel Clip 100 Harvard Apparatus 52-3746 7.5-1.75 mm
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) Schering-Plough    
Vetalar (Ketamine hydrochloride) Boniche Animal Healthcare   DIN: 01989529
Rompun (Xylazine) Bayer   DIN: 02169592
Isoflurane ABBOTT   DIN: 02032384
Hypotears eye ointment Novartis Ophtalmics   DIN: 02133288
Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) Omega L0000017 DIN: 02251477

References

  1. Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
  2. Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
  3. Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
  4. Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
  5. Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
  6. Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
  7. Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
  8. Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740 (2010).
  9. Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
  10. Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
  11. Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
  12. Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
  13. Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).

Play Video

Cite This Article
Mathieu, M., Labrecque, N. Murine Superficial Lymph Node Surgery. J. Vis. Exp. (63), e3444, doi:10.3791/3444 (2012).

View Video