ストア作動性Caの範囲<sup> 2 +</sup>エントリ(SOCE)は、蛍光Caを使用して監視することができます<sup> 2 +</sup>指標。 Mnは<sup> 2 +</sup培養細胞や骨格筋線維のような指標アッセイSOCEの>消光。機械的に皮筋線維の共焦点イメージングによるSOCEの空間分解能と時間分解能を可能にする技術も記載されています。
店は以前の容量性Ca 2 +のエントリと呼ばれる、Ca 2 +のエントリ(SOCE)を運営し、+枯渇小胞体(ER)や筋小胞体(SR)のCa 2 +ストアを補充する細胞に細胞外Ca 2 +の流入のために厳密に制御メカニズムです。 1,2。のCa 2 +ユビキタスセカンドメッセンジャーであるので、SOCEが増殖、アポトーシス、遺伝子の転写と運動性を含む細胞プロセスの様々な重要な役割を果たしているのを見て驚くことではありません。上皮細胞と骨格筋を含むほぼすべての細胞型で広い発生のため、この経路は、大きな関心3,4を受けています 。ただし、異なる細胞型と生理機能のSOCE特性の不均一性は、まだ5-7クリアされていません。
SOCEの機能チャネルのプロパティは、THIに関する知識の大きな体に対し、パッチクランプ法の研究によって明らかにすることができるの経路があるため、ハイスループットスクリーニングのため、その利便性と実現可能性の蛍光ベースの細胞内Ca 2 +測定によって得られている。このレポートの目的は、単層細胞、浮遊細胞や筋線維5,8-10でSOCEの活性化を測定するためにいくつかの蛍光ベースの方法を要約することである。最も一般的にこれらの蛍光法の使用は、直接細胞内Ca 2 +の動態を監視するために+ F 340nm、レシオメトリックのCa 2 +インジケーターフラ-2のF 波長380nm(発光波長510 nm)の比を使用しています。細胞内Ca 2から一方向SOCEの活性を分離するには+の放出とCa 2 +放出は、Mn 2 +クエンチアッセイが頻繁に使用されます。それは非常に高い親和性ウィットのために+ポンプ表面膜の押出プロセスまたはCa 2によってERの取り込みに不浸透性のある間のMn 2 +は SOCEを介して細胞に浸透することができることが知られているHフラ-2。その結果、細胞内に細胞外のMn 2 +のエントリによって誘発されるフラ-2蛍光の消光がSOCE 9の活性の測定を表しています。レシオメトリック測定とMn 2消光アッセイは、単一細胞を可視化する細胞集団モードまたは顕微鏡ベースのシステムでキュベットベースの蛍光光度計で実行することができます。単一細胞の測定の利点は、遺伝子操作を受け、個々の細胞は、遺伝子組み換えや変異細胞の研究をできるように、GFPまたはRFPレポーターを使用して選択することができることである。構造的に特殊な骨格筋でSOCEの時空間特性は、同時に二つの低親和性Ca 2 +の蛍光を監視することによって、肌の筋線維で達成することができるSRと、このようなにみたFluo-5Nとして筋線維の特定のコンパートメントを対象とした+の指標rhodo-の異形横細管9,11,12で5N。
Ca 2 +結合およびCa 2 +フリーフラ-2の励起波長は、それぞれ340nmおよび380nmであるが、Caの2のフラ-2の最高の比ダイナミックレンジ+濃度測定は、特に、他の波長で発生する可能性があります顕微鏡システム。波長のようなシフトは、通常、様々な光学部品を添加した光路の変化によるものである。本研究では、フラ-2の励起波長は、フラ-2蛍光のスペクトル解析を行うことにより、350 nmと390 nmで測定した。
を含むいくつかのソースのバランスから、細胞質ゾルの結果細胞内Ca 2 +レベル、細胞内Ca 2 +放出は、細胞外Ca 2 +のエントリと同様に、小胞体と細胞膜でのCa 2 +排除機構。細胞内Ca 2 +放出とCa 2 + EXTRから一方向のSOC-介在Ca 2 +流入を単離するために、usionは、Mn 2 +が消光アッセイを使用することができます。のMn 2 +は SOCEを介して細胞に浸透することができることが知られているが、表面膜の押し出しまたはCa 2によってERの取り込み+ポンプへの浸透です。したがって、蛍光消光は、単方向のMn 2 + SOCEの活性化の度合いを推定する細胞内へのフラックスの測定を表しています。のMn 2 +クエンチアッセイは、このような波長で、等吸収点で行わフラ-2蛍光強度がCa 2 +濃度とは無関係です。されてい各システムの等吸収点は、スペクトラム·スキャンによって決定されるべきである。また、Mn 2 +の消光は、最終的な値は、Ca 2 +濃度の13の独立しているような方法で、任意の2つの波長で調整された蛍光によって記録することができます。
骨格筋におけるSOCEの活動の空間的および時間的情報を得るために、我々は同時measuremeを可能にするデュアル色素法を採用SOCE活動のNTおよびSRのCa 2 +肌の大人の哺乳類のEDL筋線維内のコンテンツ。 SRのCa 2の変化の間に相関が+コンテンツとSOCE活動は、SRのCa 2 +貯蔵の枯渇にSOCE活性化のしきい値と感度を示すためにプロットすることができます。 TT-ローディング溶液は、さらにカルシウム2とT-細管をロードするために最適化されている+とT-細管とSR-ローディング溶液のプライミングのために最大限のSRのCa 2 +ローディングを促進し、さらにT-細管をロードするように設計されています〜500μMのCa 2 +。 FCCPは、TT / SR-ローディング溶液とミトコンドリアからの影響を排除するためにSR-オゾンソリューションに含まれています。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、読書と、この原稿を編集するために博士ノアWeislederに感謝します。この作品は、MBに0535555N ZP、XZに米国心臓協会SDG2630086、および国立衛生研究所RC2AR058962-01 MBまでに研究費補助金UMDNJ財団62から09でサポートされていました。
Table of specific reagents and equipment:
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
RPMI 1640 | Mediatech | 10-040-CV | |
Ham’s F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
DMEM | Mediatech | 10-013-CV | |
Glass Bottom Dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Fura-2 AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | -20°C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO |
Fluo-5N AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F14204 | -20°C, seal tight, protected from light |
Rhod-5N | Invitrogen (Molecular Probes) | R14207 | -20°C, seal tight, protected from light |
Quartz Cuvette | Starna Cells | 3-Q-10 | |
thapsigargin | Tocris | 1138 | |
2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) | Tocris | 1224 | |
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) | Sigma-Aldrich | 435600 | |
Collagenase Type I | Sigma | C0130 |
Equipment: