1. תאיים Ca 2 + מדידה עבור תאים בודדים KYSE-150, אדם בתא קשקש קרצינומה של הוושט (ECSS) שורת תאים בתרבית באווירה 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס מעורבת בינונית RPMI 1640/Ham של F-12 (1:1) המכילה 5% בסרום שור עוברית. KYSE-150 תאים transfected עם פלסמידים את אחד המכיל shRNA במיוחד נגד Orai1 או רצף מקושקשת. פלסמידים כלל גם קידוד גנטי חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) ככתב, אשר מונע על ידי האמרגן נפרד. התאים גדלים זכוכית התחתונה מנות (1.5 לא מכסה זכוכית, MatTek, MA) למשך 48 שעות. הסר בינוני לשטוף את התאים בתמיסת מלח מאוזנת (BSS) (140 mM NaCl, KCl 2.8 מ"מ, 2 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ MgCl 2, 10 HEPES מ"מ, ה-pH 7.2). הוסף 1 מ"ל פתרון BSS המכיל 2 מיקרומטר פורעה-2 אסתר acetoxymethyl (בדיקות מולקולריות) לתוך צלחת ולעטוף את המנה כולה בנייר כסף כדי proteCT מן האור. דגירה התאים דקות 40 על 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להשאיר אותם לתקופה נוספת 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הידרוליזה אסתר להסתיים. שוטפים את התאים עם BSS פעמיים. הר את המנה על הבמה של מיקרוסקופ TE200 Nikon הפוכה, אשר מחובר PTI spectrofluorometer, עם אורכי גל עירור ב 350 ו 390 ננומטר ופליטות ב 510 ננומטר. אורכי הגל עירור המדויקים כדי לשמש יכול מעט להשתנות בהתאם האופטיקה של מערכת בנפרד. שני אורכי הגל עם היחס הטוב ביותר דינאמי נקבעים על ידי ספקטרום עירור סריקה של מלח פורעה-2 בפתרונות המכילים Ca 2 + בטווח שבין 0 ל 39.8 מיקרומטר (או ריכוז גבוה יותר שבו פורעה-2 הקרינה רווי). להקים מערכת זלוף הכבידה עם 4 פתרונות שונים BSS: CA 2 + (2 מ"מ), EGTA (0.5 מ"מ), EGTA-TG (thapsigargin, 5 מיקרומטר), Ca 2 +-2-APB (מעכב SOCE, 75 מיקרומטר). מבוקרת מחשב אוטומטיות perfusiמערכות על יכולות לשמש אותך גם. בחר את התאים המבטאים RFP במצב להדמיה. מקם את קצה הפתיחה של מערכת זלוף בהגדלה 10x עד קצה צודק מעל אזור העניין בזווית של 45 מעלות. במקביל להקליט אותות הקרינה פריץ 350nm 390nm ו-F. יחס (350nm F / F 390nm) מוצג בחלון 3. שנה את הפתרונות זלוף בסדר הבא: Ca 2 +, EGTA, Ca 2 +, EGTA-TG, Ca 2 +, Ca 2 +-2-APB. הפרוטוקול הנ"ל יכול להיות שונה עבור מדידה של Ca 2 + תאיים במערכת ההשעיה התא. תרבות KYSE-150 תאים בקבוק T25 עם מצב התרבות כנ"ל. כאשר התאים מגיעים למפגש 90%, הסר בינוני לשטוף את התאים עם פתרון BSS. הוסף 2.5 מ"ל פתרון BSS המכיל 2 מיקרומטר פורעה, 02:00 ו דגירההתאים ב 40 דקות 37 ° C ואחריו deesterification. הסר BSS, להוסיף 2.5 מ"ל לתוך הבקבוק טריפסין ו דגירה על 37 ° C עד שהתאים לנתק. לאחר מכן הוסף 2.5 מ"ל התרבות בינוני כדי לעצור את trypsinization ו לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 סל"ד 5 דקות. שוטפים את התאים עם המדיום התרבות פעם נוספת על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות גלולה של התאים לתוך פתרון BSS (ללא תוספת של 2 מ"מ CaCl 2, המכיל מגוון מיקרומטר Ca 2 +) ולספור את מספר התאים באמצעות hematometer. הוסף ~~~HEAD=NNS 10 6 תאים לתוך קובט קוורץ (10 מ"מ, תאים Starna) ולמלא את עוצמת הקול עד 2 מ"ל עם BSS. מניחים את קובט (ערבוב עם פס מגנטי) לתוך spectrofluorometer. במקביל להקליט אותות הקרינה פריץ 340nm 380nm ו-F עם אורך גל הפליטה ב 510 ננומטר. פרוטוקול זה פועל: BSS, תוספת של 0.5 EGTA μl (0.25 מ 'מניות), תוספת של 1 thapsigargin μl(TG, המניה 10 מ"מ), תוספת של 4 μl Ca 2 + (1 מ 'מניות). 2. Mn assay מרווה בתאים בתרבית גל עירור לבצע סריקה של פורעה-2 בפתרונות שונים המכילים Ca 2 + בריכוז הנע בין 0 עד 39.8 מיקרומטר כדי לקבוע את אורך הגל ריכוז Ca עצמאית כנקודת isosbestic. בדרך כלל, נקודת isosbestic נמצא או סביב 360 ננומטר. KYSE-150 תאים בתרבית זכוכית התחתונה הכלים עמוסה פורעה-2 AM. הגדרת מערכת טפטוף עם 5 אחר פתרונות BSS: Ca 2 + (2 מ"מ), EGTA / TG (0.5 מ"מ ו 5 מיקרומטר, בהתאמה), Mn 2 + (0.5 מ"מ, ללא תוספת של EGTA או Ca 2 +, המכיל חינם Ca 2 + בטווח מיקרומטר), Mn 2 + / 2-APB (75 מיקרומטר), EGTA / טריטון X-100 (0.1%). הר את המנה על הבמה של המיקרוסקופ ובחר "יחס עירור" מצב עם אורכי גל עירור ב 360 ננומטר ו -390 ננומטר פליטה ב 510ננומטר. במקביל להקליט אותות הקרינה פריץ 360nm ו 390nm עם יחס F (F 360nm / F 390nm) מוצגת בחלון 3. פרוטוקול ריצה היא: Ca 2 + 1 דקות כדי לייצב את הקרינה, Mn 2 + למשך 30 שניות, EGTA / TG במשך 10 דקות, Mn 2 + 2 דקות, EGTA-Triton X-100 (0.1%) עבור 1 דקות כדי לקבל את הקריאה ברקע. Mn 2 + / 2-APB הפתרון יכול לשמש במקום Mn 2 + לבחון את מרווה הקרינה בוטלה, המציינת כי הכניסה Mn 2 + היא דרך מסלול SOCE. 3. Mn assay מרווה בתאי שריר C2C12, קו myogenic העכבר התא, בתרבית על הזכוכית התחתונה מנות באווירה 5% CO 2 ב 37 ° C במדיום DMEM המכילה 10% נסיוב שור עוברית, סרום סוס 10%. לאחר שהתאים מגיעים למפגש, בינוני התרבות משתנה בינוני בידול (להסיר בסרום שור עוברית reducסרום דואר סוס ל -2.5%). את C2C12 myoblasts יהיה להתמיין myotubes לאחר 4 ימים. טען C2C12 myotubes עם הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר פורעה-2 לפנות בוקר, כמתואר 1.4-1.6. הוסף הריכוז הסופי של 20 N-בנזיל-P-טולואן מיקרומטר sulphonamide (BTS) לעכב התכווצויות שרירים, והממצאים תנועה הנגרמים על ידם לאפשר 15 דקות לפני ביצוע הניסוי. הר את המנה על הבמה של המיקרוסקופ מחובר למכשיר PTI ולטעון את הפתרונות הבאים BSS למערכת טפטוף: 2 Ca 2 + (2 מ"מ), 0 Ca 2 +, Mn 2 + (0.5 מ"מ); Mn 2 + / TG (0.5 מ"מ, 20 מיקרומטר, בהתאמה). להגדיר את המערכת זלוף כמתואר לעיל. במקביל להקליט אותות הקרינה פריץ 360nm ו 390nm עם יחס F (F 360nm / F 390nm) מוצג בחלון 3. פרוטוקול זה פועל: 2 Ca 2 + דקות 1, 0 Ca 2 + דקות 1 עד FLush משם Ca 2 +, Mn 2 + 0.5 דקות, Mn 2 + / TG עבור 10 דק ', ו Mn 2 + / EGTA-Triton X-100 (0.1%). 4. SOCE נפתרה במרחב ובזמן בסיבי השריר עור הכן את הפתרונות הבאים. מאגר שוה Tyrode: 140 מ"מ NaCl, KCl 5 מ"מ, 10 מ"מ HEPES, 2 מ"מ MgCl 2, 2.5 מ"מ CaCl 2, pH 7.2, 290 mosm בינונית תרבות: DMEM עם סרום סוס 2% ו -1% פניצילין וסטרפטומיצין לשטוף פתרון # 1: 109.6 mM K-גלוטמט, 2 מ"מ EGTA-KOH, 6.7 mM MgCl 2, 2 מ"מ ATP, קריאטין mM 6 פוספט (CP), 20 מ"מ N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic חומצה (BES)-KOH, pH 7.0 לשטוף פתרון # 2: 140 מ"מ K-גלוטמט, 5 מ"מ EGTA-KOH, 6.5 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ ATP, CP 6 מ"מ, 20 מ"מ BES-KOH, pH 7.0 הפשטה הפתרון: 140 מ"מ K-גלוטמט, 6.5 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ ATP, CP 6 מ"מ, 20 מ"מ BES-KOH, pH 7.0 TT-Loadingהפתרון: 90.6 mM K-גלוטמט, 18 מ"מ Na-גלוטמט, 0.55 mM CaCl 2, 2 מ"מ EGTA-KOH, 6.7 mM MgCl 2, 5.4 mM ATP, 15 מ"מ CP, 0.0025 מ"ג / מ"ל קריאטין קינאז (CK), 20 מ"מ BES-KOH, קרבוניל 5 מיקרומטר ציאניד P-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), pH 7.0, 7.0 PCA SR פתרון טוען: 107.8 mM K-גלוטמט, 0.98 mM CaCl 2, 2 מ"מ EGTA-KOH, 6.6 mM MgCl 2, 5.4 mM ATP, 15 מ"מ CP, 0.0025 מ"ג / מ"ל CK, 20 מ"מ BES-KOH, 5 מיקרומטר FCCP, pH 7.0, 6.6 PCA SR פתרון ומכלה: 100 מ"מ K-גלוטמט, 40 מ"מ Na-גלוטמט, 10 mM EGTA-KOH, 10 mM 1,2-bis (O-aminophenoxy) אתאן-N, N, N ', סוג ב tetraacetic חומצה (BAPTA ), 0.35 mM MgCl 2, 0.5 מ"מ ATP, 1 mM CP, 20 מ"מ BES-KOH, 5 מיקרומטר FCCP, pH 7.0. 25 caffeine/20 mM מיקרומטר thapsigargin (TG) מתווספים לפני ניסויים. לנתח מאריך digitorum (אדי) שריר longus, 1 להניח את העכברים ולסדר את הרגל במיקום לרוחב, ולאחר מכן להסיר את העור מאזור הקרסול עד הברך, לחתוךשכבות השרירים השטחיים של רקמות לחשוף את אדי, ולנתק את שני הגידים העליון והתחתון על מנת לשחרר את השרירים אדי שלם, חשוב לשמור על הגידים זמן רב ככל האפשר. אדי מועבר פתרון Tyrode המכיל 0 Ca 2 + ו – 0.1 מ"מ EGTA למנוע התכווצויות. תחת סטראו, להשתמש בשני פינצטה להחזיק גידים הכניסה נמוכות יותר ולפצל את השריר אדי לשתי חבילות. חזור על התהליך כדי לקבל 4 ואז 8 חבילות. זה קריטי, כי הגידים נשארים לכל אחת 8 חבילות בסוף התהליך. אם הם הולכים לאיבוד בין חבילות מסוימים, להתעלם מהם. תחת סטראו, רצועת כל חבילה אדי הוא קיטר על הגידים בשני ומתח בזהירות עד 3 ~ 4 סיבי השריר מופרדים בודדים נותרים ללא שינוי עם גיד משני הצדדים. שים 1 טיפה של Ca 2 + חיץ tyrode חינם באמצע צלחת זכוכית התחתונה, להניח את רצועות אדי ישר על צלחת, להסיר במהירות ככל האפשר שלהפתרון, אז קלטת את שני הגידים באמצעות סקוץ' עמיד במים הקלטת, ולוודא את הקלטת הוא הדוק. שטפו את סיבי 1 עם פתרון 0 Ca + 2 ולאחר מכן מ"מ 2.5-CA 2 + פתרון 2 פעמים. אם סיבים Hyper-חוזים הנזק לב, לבטל את סיב. במידת הצורך, סיבים יכול להיות מתורבת של עד 96 שעות, ומאפשר מניפולציות גנטיות. שטפו את סיבי 3 פעמים עם המדיום תרבות שלמה להוסיף 2 בינוני מ"ל לתוך התבשיל, מקום 5% CO 2 ו – 37 ° C חממה. לפני כל ניסוי, לבחון את סיבי השריר וזורקים אלו ללא striation ברור או עם סימנים של זיהום, או עם סימנים של נזק כגון התכווצות של קרום sarcolemmal. סיבים טובים להגיב לגירוי, KCl חשמל, גירוי קפאין. סיבי שריר בודדים נשטפים 3 פעמים עם פתרון לשטוף # 1 ו שטוף פתרון תאיים כמו הפשטה עם 500 מיקרומטר Rhod-5N ו 0.5 מ"מ של CA 2 + דקות 5. <li> באמצעות מחט טונגסטן מחובר בעל קוד אישי, מכנית העור סיבים תחת סטראו, המאפשר tubules רוחביים (TT) עד reseal באופן אוטומטי כדי ללכוד Rhod-5N מצומדות עם Ca 2 + ב TT, לשטוף את סיבי עור פעמיים עם כביסה פתרון # 2. תהליך הפשטה מכני הוא אופטימלי כאשר פחות מ 25% של רוחב התא יוסר במהלך תהליך הפשטה. כדי לטעון את SR, סיבי עור מודגרת פתרון הפשטה המכיל 20 מיקרומטר Fluo-5N הרכב עבור H 1 בטמפרטורת החדר, ואחריו שוטף נרחבים באמצעות פתרון הכביסה # 2, דגירה של 30 דק 'נוספות כדי לאפשר להשלים דה esterification של צבע. אחרי 30 דקות, סיבי עור הם דמיינו תחת המטרה של 60x מיקרוסקופ confocal. תמונות הקרינה נרכשים באורכי גל של צבעים המתאימים (עירור ב 543 ננומטר ופליטות זמן רב יותר מאשר 570 ננומטר עבור Rhod-5N, עירור ב 488 ננומטר ופליטות ב 530-560 ננומטר עבור Fluo-5N). Regiתוספות של עניין (ROIs) נבחרו עבור כל צבע באזורים טעונים. פרוטוקול הניסוי הוא כדלקמן: TT-loading פתרון פתרון של 120 SR-טוען, כי הפתרון של 120 SR-דלדול, על 400-750 של לכלות Ca SR 2 + חנות. במהלך תהליך זה, שינויים בעוצמת Rhod 5N-TT (Ca 2 +) ו-5N Fluo בעוצמה (SR Ca 2 +), נרשם, יצירת כמובן זמן קביעת שינויים הקרינה היחסית בשוק TT ו-SR. משמעות הערכים של עוצמת הקרינה של סיבים מרובים מנותחים יותר. עוצמת העמסה מרבית בסוף TT / SR-loading מנורמל ל 100%. 5. נציג תוצאות בדקנו את הפעילות SOCE ב KYSE-150 תאים באמצעות תאיים Ca 2 + מדידה (איור 2.). באמצעות RFP ככתב, נוכל לבחור את תאים בודדים transfected עם shRNA פלסמיד המכיל ספציפית נגד orai1, הגן המקודד את ג SOCEhannel. לעומת תאים transfected עם פלסמידים המכילים לטפס shRNA (שחור זכר), דריסה של Orai1 תוצאות חלבון בפעילות SOCE ירד (סימן אדום). SOCE ב KYSE-150 תאים אושר גם עם Mn 2 + assay מרווה (איור 3.). גל עירור של 360 ננומטר מדווח נקודת isosbestic של פורעה-2, שם הקרינה אינה תלויה בריכוז 2 + Ca. לאחר TG מדולדל לחלוטין ER Ca 2 + חנויות, טפטוף של Mn 2 + לירידה הקרינה משמעותית. הפעילות כוללת SOCE ניתן למדוד שיעור ירידה של עוצמת הקרינה פורעה 2-בשיפוע תלול יותר המציין SOCE פעיל יותר, בעוד משמעות שיפוע רדוד SOCE פעיל פחות. שיפוע ירידה הקרינה ב 2-APB תאים שטופלו נראה הרבה יותר רדוד, אשר ציין כי פעילות SOCE נחסם המתחם הזה. Mn2 + שיעורי מרווה נקבעו מהרשומה של 10 שניות הראשונות, שבהם מרווה היה עדיין בטווח ליניארי ללא הרוויה. דומה Mn 2 + assay מרווה בוצעה שריר (איור 4.). במקרה זה Mn 2 + יושמה יחד עם TG. בעוד TG היה מכלה את האישורים SR + 2 חנויות, במדרון מרווה הקרינה בהדרגה השתנה עד שהגיע בשיעור המקסימאלי. עקומת sigmoidal מציין הפעלה מדורגת של SOCE בתנאים ניסיוניים. בריאים שלמים סיבי שריר בודד בתרבות הראה striation ברורה ואחידה, ללא סימנים של זיהומים, ואין סימנים של נזק הנגרם ע"י התכווצות. סיבים אלו היו מסוגלים להתכווץ בתגובה לגירוי חשמלי או פתרונות depolarizing. תחת הדמיה confocal, השמנה סיבים עור של Rhod-5N צבע בתא TT הראו דפוס אופייני כפיל יונקים (visualized בערוץ אדום). לאחר הטעינה של SR עם Fluo-5N בבוקר, דפוס אופייני SR מנוקד נראה (בערוץ ירוק). עם טפטוף של סיבי עור עם פתרון TT / SR טוען, עוצמת הקרינה של שניהם Rhod-5N ו Fluo-5N גדל, על זלוף פתרון דלדול SR, רמות הקרינה בתא SR ואת תא TT התחיל לרדת, המעיד על צימוד חזק בין SR Ca 2 + דלדול החנות והפעלה SOCE, בהתאמה (איור 5.). באיור 1. הפעלת חנות המופעל Ca 2 + כניסה (SOCE). Orai1, נקבוביות ערוץ להרכיב יחידה, ממוקם על הממברנה (PM) ו STIM1, 2 Ca + חיישן, ממוקם על reticulum endoplasmic או sarcoplasmic (ER / SR) ממברנות. כאשר ER / SR Ca 2 חנויות + מופחתים או עקב חסימה של ER / SR Ca 2 + משאבה (SERCא) או Ca 2 + שחרור דרך קולטן 3 IP או קולטן ryanodine, STIM1 מופעל. הופעל STIM1 מולקולות ליצור כתמים ולגרום צבירה של Orai1, אשר נוסף מוביל את ההפעלה של SOCE. איור 2. מדידת Ca תוך תאי 2 + ב KYSE-150 תאים. Exchange של פתרון תאיים בין 0 Ca 2 + (0.5 מ"מ EGTA) עד 2 מ"מ Ca 2 + לא לגרום כל שינוי תאיים Ca 2 +. 5 מיקרומטר TG ב 0 Ca 2 + פתרון אמבטיה המושרה פסיבית ER Ca 2 + שחרור. לאחר ER Ca 2 + חנויות היו מרוקנים (> 10 דקות), תוספת של תאי Ca 2 + (2 מ"מ) מופעל מתמשכת תאיים Ca 2 + דרך העלאת SOCE, אשר יכול להיחסם על ידי מעכבי SOCE, למשל SKF-96365 ו 2 – APB (הנתונים לא מראים). תאים transfected עם פלסמידים המכילים shRNA במיוחד נגדorai1 (אדום) הראו באופן משמעותי SOCE מופחת מאשר תאים transfected עם רצף לטפס (שחור). איור 3. Mn 2 + assay מרווה של SOCE ב KYSE-150 תאים. מרווה של הקרינה פורעה על ידי 2-Mn 2 + (0.5 מ"מ) נמדד ב Ca 2 + ללא תלות באורך גל עירור של פורעה-2 (360 ננומטר). התאים טופלו 5 מיקרומטר TG במשך 10 דקות כדי לרוקן לחלוטין את חדר המיון של CA 2 + חנויות. שיפוע הדעיכה של הקרינה-2 פורעה על Mn 2 + תוספת (קווי מקף, בתוך 10 שניות 1) ייצג את הפעלת SOCE, אשר באה לידי ביטוי כירידה אחוז הקרינה ליחידת זמן (הערך הראשוני כ% 100). אותות הקרינה הרווה מקסימאלי הוקמה בסוף הניסוי על ידי lysing את התאים עם 0.1% טריטון X-100 (כ% 0). תאים שטופלו 2-APB (75 מיקרומטר) הפגינו הרבה יותר רדוד, דבר המצביע על מדרון SOCE חוסמת מתחם זה KYSE-150 תאים. באיור 4. הפעלה מדורגת של SOCE בתאי שריר שנחשפו על ידי Mn 2 + assay מרווה. הפעלת SOCE יכול להירשם תוך TG היה ומכלה SR Ca 2 + חנויות. יישום בו זמני של Mn 2 + (0.5mm) ו TG (20 מיקרומטר) הנגרמת על ירידה מדורגת ו sigmoidal תאיים של מרווה פורעה-2 + הקרינה (קו כחול מקף להראות את נקודת מרווה המהיר ביותר), אשר היה שונה Mn הראשונית 2 שיעור (קו כחול מקף). Mn 2 + שיפוע מרווה נשאר כמעט זהה לרמת הבסיס בתאים שטופלו 2-APB (75 מיקרומטר), דבר המצביע על כך SOCE היה עצור. איור 5. נפתרה במרחב ובזמן SOCE בסיבים שרירים עור. (א) Rhod-5N מלח נטען לתוך TT ו-5N Fluo AM נטען לתוך SR. (ב ') לאחר החלת Ca 2 + פתרון דלדול, הקרינה הן TT ותאים SR ירד. אובדן Fluo-5N הקרינה עולה שוחרר במהירות SR Ca 2 + תכנים אובדן Rhod-5N הקרינה הציע הפעלת SOCE.