We beschrijven het gebruik van een muis ES-cel-gebaseerde test kritische tijdvensters voor de Wnt / β-catenine en BMP signaal activering tijdens cardiogene inductie te identificeren. De methode biedt een gestandaardiseerd platform dat betrouwbaar kwantificeert cardiogene efficiëntie, en het is van toepassing op de studie van andere cellijnen.
Differentiatie van pluripotente stamcellen wordt streng gecontroleerd door de temporele en ruimtelijke regulering van meerdere belangrijke signaalwegen. Een van de obstakels om haar te begrijpen is het gevarieerde methoden in correleren van veranderingen van belangrijke gebeurtenissen signalering tot differentiatie efficiency. We beschrijven hier het gebruik van een muis embryonale stamcellen (ES) cel-gebaseerde test kritische tijdvensters voor de Wnt / β-catenine en BMP signaal activering tijdens cardiogene inductie te identificeren. Door het scoren voor het oplopen van embryonale organen (EBS) in een 96-well plaat formaat, kunnen we snel kwantificeren cardiogene efficiency en identificeren van cruciaal moment ramen voor Wnt / β-catenine en BMP-signaal activering in een tijdsverloop volgende specifieke modulator behandelingen. De belangrijkste hier beschreven is niet beperkt tot cardiale inductie alleen, en kan worden toegepast op de studie van vele andere cellijnen. Daarnaast is de 96-well formaat heeft de potentie om verder te worden ontwikkeld als een high throughput, geautomatiseerde test om te zorgen voor het testen van meer geavanceerde experimentele hypothesen.
De opknoping druppel methode is de conventionele methode die wordt gebruikt voor EB vorming en in vitro differentiatie. Het is echter bewerkelijk en de grenzen experimentele flexibiliteit als gevolg van logistieke problemen. Op dezelfde wijze, resultaten zijn ook moeilijker te valideren als de vaardigheid van de onderzoeker is cruciaal voor een succesvolle EB vorming en manipulatie als opknoping daalt. Een eenvoudiger methode is om EBS vorm in een ronde bodem 96-well plaat als een single-step proces. Dit formaat kan in vitro differentiatie worden gestandaardiseerd en kan meer experimentele omstandigheden te wijten aan het gemak van EB vorming en stroomafwaarts manipulatie (bijv. modulator toevoegen of verwijderen). Bovendien kan de 96-well plaat formaat worden geoptimaliseerd om een efficiënte screening tool in de muis ES-cellen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door Veterans Affairs en NIH beurzen 5U01HL100398 en 1R01HL104040.