השתנה עכבר תא גזע עובריים Assay מבוסס על כימות יעילות אינדוקציה קרדיוגני
Summary
אנו מתארים את השימוש assay ES תא העכבר מבוסס לזהות חלונות זמן קריטי עבור Wnt / β-catenin והפעלה BMP אות במהלך אינדוקציה קרדיוגני. השיטה מספקת פלטפורמה סטנדרטית אשר מכמת אמין יעילות קרדיוגני, וזה החלים על המחקר של שושלות תאים אחרים.
Abstract
דיפרנציאציה של בתאי גזע pluripotent נתונה לפיקוח הדוק על ידי ויסות של זמן ומרחב של מספר מסלולי איתות מפתח. אחד המכשולים כדי הבנה שלה כבר בשיטות מגוונות correlating שינויים של אירועים איתות מפתח יעילות בידול. אנו מתארים כאן את השימוש assay עובריים בעכבר (ES) בתאי גזע מבוסס לזהות חלונות זמן קריטי עבור Wnt / β-catenin והפעלה BMP אות במהלך אינדוקציה קרדיוגני. עד מניה קבלנות גופים עובריים (EBS) בתבנית צלחת 96-טוב, אנחנו יכולים במהירות לכמת יעילות קרדיוגני ולזהות חלונות זמן קריטי עבור Wnt / β-catenin והפעלה BMP אות במהלך זמן לאחר טיפולי אפנן ספציפיים. המנהל המתוארים כאן אינו מוגבל אינדוקציה לב לבד, יכול להיות מיושם כלפי המחקר של שושלות תאים רבים אחרים. בנוסף, פורמט 96-היטב יש פוטנציאל להיות מפותחים יותר כמו תפוקה גבוהה, assay אוטומטית כדי לאפשר בדיקה של השערות ניסיוניות מתוחכמות יותר.
Protocol
Discussion
השיטה ירידה תלוי כבר את השיטה המקובלת משמש ליצירת EB ו בידול חוץ גופית. עם זאת, מייגע גבולות הגמישות ניסיוני בשל חששות לוגיסטית. באותה מידה, תוצאות גם קשה יותר כדי לאמת את המיומנות של הנסיין הוא חיוני להיווצרות EB מניפולציה מוצלחת כמו טיפות תלוי. שיטה פשוטה יותר היא ליצור EBS בצלחת תחתית עגולה 96, וכן תהליך יחיד צעד. פורמט זה מאפשר בידול בתוך מבחנה להיות סטנדרטי יכול להכיל יותר תנאי הניסוי בשל הקלות של היווצרות EB ומניפולציה במורד הזרם (למשל בנוסף אפנן או הסרה). יתר על כן, 96-היטב את התבנית צלחת יכול להיות מותאם להיות כלי סינון יעיל בתאי גזע עובריים בעכבר.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי לענייני יוצאי צבא ו-NIH מענקים 5U01HL100398 ו 1R01HL104040.
Materials
- Mouse CGR8 cells are mainly used.
- ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercaptoethanol, and 200 U/ml murine LIF.
- EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercaptoethanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution.
References
- Fukuda, K., Yuasa, S. Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes. Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).
- Foley, A. C., Mercola, M. Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex. Genes Dev. 19, 387-396 (2005).
- Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).
- Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).
