Summary

遺伝的に標識された網膜神経節細胞からの光は応答を記録するために隔離された網膜の準備

Published: January 26, 2011
doi:

Summary

この記事では、細かく分析し、マウスで分離された網膜の準備から記録する方法の説明を提供します。特に、我々は、蛍光標識神経節細胞集団からの光の応答を記録し、続いてその形態を特定し分析する方法について説明します。

Abstract

光が網膜1のロッドと錐体光受容体を刺激するときに脊椎動物のビジョンの最初の手順が行われます。その後、この情報は、ONとOFF経路として知られているものに分けています。光強度の増大(BCSオン)または減少(BCSオフ)に反応して脱分極、双極細胞に光受容体の信号光情報(BCS)、。光情報のこの分離は、彼らがオフのBCから直接興奮性入力を受け取る内網状層(IPL)のオフsublamina、のいずれかで層化樹状突起を持つ網膜神経節細胞(RGCs)、のレベルで維持、またはに階層化され彼らはBCの上から直接興奮性入力を受け取るIPLの上sublamina、。照明の増減に関する情報(経路オンとオフ)のこの分離は、保存と並行して脳に通知されます。

RGCsは、網膜の出力細胞であるため、光情報は脳内の視覚的な核に通知される方法を理解するために勉強する重要な細胞です。ここ数十年にわたって、マウス遺伝学の進歩により、特定のRGC集団が電気生理学的記録のために標的とRGCサブタイプ2 3 4と特定の識別を可能にするために蛍光タンパク質で標識されている蛍光レポーターマウス系統の様々をもたらしました。ここで、我々はそのまま、孤立した網膜準備で蛍光標識神経節細胞からの光の応答を記録するための手法を提案する。この孤立した網膜の準備は、樹状アーバが損なわれていないと全体のRGC樹あずまやでの入力が保たれているRGCsから録音することができます。このメソッドは、神経節細胞のサブタイプの多様にわたって適用可能であり、単一細胞生理学的手法を用いての多種多様に従順です。

Protocol

動物の使用に関する声明:動物は、ミネソタ動物実験の大学および使用委員会によって承認されたプロトコルを使用して、 実験動物の管理と使用に関するガイドに記載されているガイドラインに準拠して世話をした。 1)溶液の調製は、 電気生理学的細胞内記録、、外、及び酵素のソリューションを実行する前に準備する必要があります。 </…

Discussion

この手法は、単離網膜から網膜神経節細胞の録音にも適用可能である。本質的に感光性の上に使用されるマウスのラインでも、メラノプシン発現RGCsがEGFP 2、5で標識され、このプロトコルは、他の蛍光標識RGCラインに容易に譲渡することはできませんかだけでなく、ランダムに選ばれたRGCsから記録するために一般化することができる。各RGCとそのそれぞれの入力ニューロンの樹状東?…

Acknowledgements

この作品は、NIH R01EY012949、R21EY018885、T32 EY0707133からの補助金によって部分的にサポートされていました。我々は彼の技術支援のためにダーウィンハングに感謝。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Ames’ Medium   Sigma A1420  
Collagenase   Whorthington Biochemical LS005273  
Hyaluronidase   Whorthington Biochemical LS002592  
Sodium Bicarbonate   Sigma S5761  
AlexaFluor 594 Hydrazyde   Invitrogen A10442  
Neurobiotin   Vector Laboratories SP1120  
Electrodes   Sutter Instruments BF120-69-10  
Forceps   Fine Science Tools 11252-30  
Ophthalmologic Scissor   Fine Science Tools 15000-00  
Streptavidin 594   Invitrogen S32356  
Vectashield   Vector Laboratories H-1000  
Goat Serum   Jackson ImmunoResearch 005-000-001  
Triton X-100   Sigma T8787  
Paraformaldehyde   Electron Microscopy Sciences 19210  

References

  1. Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).
  2. Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development. J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).
  3. Huberman, A. D. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62, 327-334 (2009).
  4. Siegert, S. Genetic address book for retinal cell types. Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
  5. Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29, 476-482 (2009).
  6. Newman, E. A., Bartosch, R. An eyecup preparation for the rat and mouse. J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).
  7. Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. 신경과학. 160, 126-139 (2009).
  8. Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision. J Neurosci. 27, 692-699 (2007).
  9. Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination. J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).
  10. Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina. Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).

Play Video

Cite This Article
Schmidt, T. M., Kofuji, P. An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (47), e2367, doi:10.3791/2367 (2011).

View Video