Summary

Leukotriene B의 실시간 영상 4 중재 셀 마이 그 레이션 및 β - arrestin로 BLT1 상호 작용

Published: December 23, 2010
doi:

Summary

본 논문은 특정 리간드에 leukocytes의 chemotactic 응답을 확인하고 라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 세포 표면 수용체와 cytosolic 단백질 사이의 상호 작용을 식별하는 방법을 설명합니다.

Abstract

G – 단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 일곱 transmembrane 단백질 제품군에 속하는 및 세포내 반응하는 세포 신호 전달을 중재. GPCRs 제어 등 chemotaxis와 같은 다양한 생물 학적 기능, 세포내 칼슘 릴리스 heterotrimeric G – 단백질 1-2 통해 리간드에 의존적인 방식으로 유전자 규정. 리간드 바인딩은 순환 아데노신 monophosphate (CAMP), 이노시톨의 삼인산 (IP3)와 diacyl 글리세롤 (DG)로 두번째 사자의 수준을 조절 heterotrimeric G – 단백질의 활성화로 이어지는 conformational 변화 일련의 유도. 수용체 리간드 바인딩의 활성화와 함께 수반하는 또 desensitization, 격리 및 / 또는 국제화를 통해 신호 수용체를 자제하는 이벤트의 시리즈를 시작합니다. GPCRs의 desensitization 과정은 G – 단백질 수용체 kinases (GRKs)과 β – arrestins 3 이후 결합하여 수용체의 인산화 통해 발생합니다. β – arrestins은 cytosolic 단백질이며 수용체 내면화 4-6을 촉진하여가 (대부분의 경우) phosphorylated 수용체에 결합, GPCR 활성화에 막으로 이동시키다.

와 LTB 4 수용체 2 (BLT2, 낮은 친화 수용체, Leukotriene B 4 (LTB 4) GPCRs, LTB 4 수용체 1 (고친 화성 수용체 BLT1)을 통해 arachidonic의 산성 경로 및 mediates의 행동에서 파생된 프로 염증성 지질 분자이다 ) 7-9. LTB 4 BLT1 경로는 천식, 관절염 및 죽상 경화증 10-17, 등 여러 가지 염증 질환에 중요한 것으로 표시되었습니다. 현재 신문은 LTB 4 유도된 백혈구 마이 그 레이션 및 BLT1의 상호 작용 β – arrestin과, 현미경 이미징 기술을 사용하여 18-19 살 세포 수용체의 translocation을 모니터하기 위해 개발된 방법을 설명합니다.

C57BL / 6 마우스에서 돌기 세포를 파생 골수는 격리 및 이전에 20-21을 설명한 교양되었습니다. 이러한 전지는 LTB 4 유도된 세포 마이 그 레이션을 보여주는 라이브 셀 이미징 방법으로 테스트되었습니다. 인간 BLT1는 녹색 형광 단백질 (β – 도착지 – GFP)로 태그가 C – 말단과 β – arrestin1에서 적색 형광 단백질 (BLT1 – RFP)를 지정하여 랫 Basophilic Leukomia (RBL – 2H3) 세포 라인에 plasmids 모두 transfected했습니다 18-19. 이러한 단백질 및 현지화 사이의 상호 작용 속도론는 라이브 세포 영상 현미경을 사용하여 모니터링할되었습니다. 현재 논문의 방법론은 라이브 세포에서 G 단백질 결합 수용체의 기능 반응을 조사하기 위해 미세 기술의 사용을 설명합니다. 현재 종이는 또한 수용체의 반응 속도론과 cytosolic 단백질 상호 작용을 결정하는 형광 강도를 정할 Metamorph 소프트웨어의 사용에 대해 설명합니다.

Protocol

방법론 현미경에 대한 설명 라이브 셀 이미징 실험 이클립스 TE300 니콘 인버티드 현미경에 부착된 TE – FM 에피 형광 시스템을 사용하여 수행된. 현미경 난방 무대를 갖춘. 멋진 스냅 HQ 디지털 B / W CCD (로퍼 과학) 카메라와 LAMDA 10-2 광학 필터 체인저 (서터 악기 회사) 현미경에 첨부되어 있습니다. 여기 및 발광 파장은 필터 바퀴 제어 및 Lamba 10-2 필터 휠 컨트롤…

Discussion

라이브 셀 이미징들은 실시간으로 발생과 같은 특정 단백질의 기능과 상호 작용을 설명하는 강력한 도구입니다. 이 논문에서 설명하는 방법은 명확하게 LTB 4 돌기 세포의 빠른 마이 그 레이션을 일으킬 수 보여줍니다. 이러한 방법은 다양한 세포 유형 LTB 4 기능의 측면뿐만 아니라 확장, 그들은 유사한 방법을 다른 chemokines의 다양한 적용 및 다른 백혈구 하위 집단에 대한 chemotactic…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

연구는 보건 보조금 국립 연구소 AI – 52381, CA138623 및 켄터키 폐암 연구위원회와 제임스 그레이엄 브라운 암 센터에서 제도적 지원에 의해 지원됩니다.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Cell lines:        
Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells.   ATCC CRL-2256  
Media:        
Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM)   Invitrogen 11995  
Phenol red free RPMI or DMEM   Invitrogen 11835-030  
Fetal Bovine Serum   Invitrogen 16000-044  
L-Glutamine (200 mM)   Invitrogen 25030  
Penicillin-streptomycin (10000 U/mL)   Invitrogen 15140  
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid   Invitrogen 25300  
HEPES (1M)   Invitrogen 15630  
Others:        
35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish)   WPI FD35-100  
Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad)   Bio-Rad 16552088  
Instruments/software:        
Gene Pulser II electroporater   Bio-Rad    
TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300   Nikon    
Metamorph Software   Universal Imaging    
Vertical Micro-pipette puller   Narishige International    
Micro-Forge M-900   Narishige International    
Hadraulic Micromanipulator MO-188NE   Narishige International    
Coarse Manual Manipulator, MN-188NE   Narishige International    
cDNA constructs:        
cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP)   Jala et al 2005    
cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study).   Jala et al 2005    

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Cite This Article
Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with β-arrestin. J. Vis. Exp. (46), e2315, doi:10.3791/2315 (2010).

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