Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme 4 Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri
Summary
Bu yazıda, özel ligandlar lökositlerin kemotaktik yanıt belirlemek ve hücre yüzey reseptörleri ve sitozolik proteinler canlı hücre görüntüleme teknikleri kullanarak arasındaki etkileşimleri tanımlamak için metodolojiyi tanımlamaktadır.
Abstract
G-protein reseptörler (GPCRs) yedi transmembran protein ailesine ait olan ve hücre içi yanıtları ekstraselüler sinyallerin transdüksiyon arabuluculuk. GPCRs kontrolü gibi kemotaksis gibi çok çeşitli biyolojik fonksiyonları, hücre içi kalsiyum salınımını, ligand bağımlı bir şekilde heterotrimeric G-proteinleri 1-2 ile gen regülasyonu . Ligand bağlanması, siklik adenozin monofosfat (cAMP), inositol trifosfat (IP3) ve diacyl gliserol (DG) gibi ikinci haberciler düzeyleri modüle heterotrimeric G-proteinleri aktivasyonu önde gelen yapı değişiklikleri bir dizi neden olur. Reseptör ligand bağlama aktivasyonu ile eş zamanlı, aynı zamanda, duyarsızlaştırma, haciz ve / veya içselleştirilmesi yoluyla sinyalizasyon reseptör azaltmak için bir dizi etkinlik başlatır. GPCRs duyarsızlaştırma süreci, G-protein reseptör kinazlar (GRKs) ve β-arrestins 3 sonraki bağlanma reseptör fosforilasyon yoluyla oluşur . β-arrestins sitozolik proteinleri ve reseptör içselleştirilmesi 4-6 kolaylaştırarak var (çoğu durumda) fosforile reseptörlerine bağlanarak GPCR aktivasyon üzerine membran yerini değiştirmek.
Ve LTB 4 reseptörü 2 (BLT2; düşük afinitesi reseptör; lökotrien B 4 (LTB 4), araşidonik asit yolağı ve aracılık eylemleri GPCRs, LTB 4 reseptörü 1 (afinitesi yüksek bir reseptörün BLT1) yoluyla elde edilen bir pro-inflamatuar lipid molekülünün . ) 7-9. LTB 4-BLT1 yolağı, astım, artrit ve ateroskleroz 10-17 dahil olmak üzere birçok iltihabi hastalıklar kritik olduğu gösterilmiştir . Geçerli kağıt LTB 4-kaynaklı lökosit göçü ve BLT1 etkileşimler ile β-arrestin ve mikroskopi görüntüleme teknikleri kullanılarak 18-19 canlı hücrelerde reseptör translokasyon izlemek için geliştirilen metodolojileri açıklanmaktadır.
Kemik iliği elde edilen C57BL / 6 farelerinde dendritik hücreler izole edilmiş ve daha önce 20-21 açıklandığı gibi kültüre edildi. Bu hücreler, canlı hücre görüntüleme yöntemleri LTB 4 indüklenen hücre göçü göstermek için test edildi . Insan BLT1 yeşil floresan protein (β-dizi-GFP) ile etiketlenen C-terminalindeki ve β-arrestin1 kırmızı floresan proteini (BLT1 RFP) etiketli ve Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) hücre hatları her iki plazmid transfekte 18-19. Bu proteinler ve yerelleştirme arasındaki etkileşimin kinetiği canlı hücre video mikroskopi kullanılarak takip edildi. Geçerli kağıt metodolojileri, canlı hücrelerin G-protein reseptörler fonksiyonel yanıtları incelemektir mikroskobik teknikler kullandıklarını açıklarlar. Reseptör kinetiği ve sitozolik protein etkileşimleri belirlemek için floresan yoğunlukları ölçmek için de geçerli kağıt Metamorph yazılım kullanımını açıklar.
Protocol
Discussion
Canlı hücre görüntüleme, gerçek-zamanlı olarak meydana olarak spesifik proteinlerin fonksiyonu ve etkileşimleri göstermek için güçlü bir araçtır. Bu yazıda anlatılan yöntemleri açıkça LTB 4 dendritik hücrelerin hızlı göç neden olduğunu göstermektedir. Bu yöntemler sadece LTB 4 fonksiyon çeşitli hücre tipleri yönlerini genişletin, benzer yöntemlerle diğer kemokinler çeşitli uygulanan ve farklı lökosit alt popülasyonları üzerinde kemotaktik ajanlar olarak et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağlık hibe AI-52.381, CA138623 ve Kentucky Akciğer Kanseri Araştırma Kurulu ve James Graham Brown Kanser Merkezi'nden kurumsal destek tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell lines: | ||||
| Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. | ATCC | CRL-2256 | ||
| Media: | ||||
| Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | ||
| Phenol red free RPMI or DMEM | Invitrogen | 11835-030 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030 | ||
| Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300 | ||
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | ||
| Others: | ||||
| 35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) | WPI | FD35-100 | ||
| Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | ||
| Instruments/software: | ||||
| Gene Pulser II electroporater | Bio-Rad | |||
| TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 | Nikon | |||
| Metamorph Software | Universal Imaging | |||
| Vertical Micro-pipette puller | Narishige International | |||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | |||
| Hadraulic Micromanipulator MO-188NE | Narishige International | |||
| Coarse Manual Manipulator, MN-188NE | Narishige International | |||
| cDNA constructs: | ||||
| cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | |||
| cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). | Jala et al 2005 |
References
- Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
- Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Lefkowitz, R. J. G. protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization. J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).
- Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling. Biochem J. 375, 503-515 (2003).
- . Beta-arrest or. Nature. 383, 447-450 (1996).
- Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines. Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).
- Tager, A. M., Luster, A. D. BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).
- Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T. Leukotriene B4 receptors. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69, 575-585 (2002).
- Haribabu, B. Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis. J Exp Med. 192, 433-438 (2000).
- Subbarao, K. Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators. Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).
- Heller, E. A. Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment. Circulation. 112, 578-586 (2005).
- Miyahara, N. Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).
- Terawaki, K. Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses. J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).
- Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice. J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J Exp Med. 203, 829-835 (2006).
- Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors. J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells. Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).
- Del Prete, A., A, . Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function. Blood. 109, 626-631 (2007).
- Salogni, L. Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14. Blood. 113, 5848-5856 (2009).
- Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J Vis Exp. , (2008).
