Mätning av dynamiska glykosomala pH-förändringar i levande Trypanosoma brucei

Parasitiska kinetoplastider, liksom de flesta levande organismer, förlitar sig på glukos som en grundläggande komponent i den centrala kolmetabolismen. Till denna grupp hör medicinskt viktiga organismer, såsom den afrikanska trypanosomen, Trypanosoma brucei; den amerikanska trypanosomen, T. cruzi; och parasiter av släktet Leishmania. Glukosmetabolismen är avgörande för parasittillväxt i de patogena livscykelstadierna. Till exempel, när den berövas glukos, dör blodomloppet (BSF) av den afrikanska trypanosomen snabbt. Noterbart är att glykolys fungerar som den enda källan till ATP under detta stadium av infektion¹. Leishmania-parasiter är också beroende av glukos i den mänskliga värden, med amastigote-livscykelstadiet som finns i värdmakrofager som är beroende av denna kolkälla för tillväxt².

Även om dessa parasiter har olika livsstilar som involverar olika insektsvektorer, har de många gemensamma drag i hur de reagerar på och konsumerar glukos. Till exempel lokaliserar dessa parasiter de flesta glykolytiska enzymer till modifierade peroxisomer som kallas glykosomer. Denna kinetoplastidspecifika organell är besläktad med däggdjursperoxisomer baserat på bevarade biosyntetiska mekanismer och morfologi 3,4,5,6.

Uppdelningen av de flesta av de glykolytiska enzymerna i glykosomen erbjuder parasitspecifika sätt att reglera vägen. Med hjälp av en kemisk pH-sond fastställde vi att näringsbrist utlöser en snabb försurning av procykliska form (PF) parasitglykosomer som resulterar i förändrad glykolytisk enzymaktivitet genom exponering av ett allosteriskt regulatorbindningsställe på det viktiga glykolytiska enzymet hexokinas ^7,8. I vårt tidigare arbete krävde den kemiska sonden konstant leverans för användning, vilket begränsade dess användbarhet i andra applikationer. Dessutom begränsade utmaningar med att upprätthålla sondfördelningen i glykosomen i BSF användbarheten av metoden för att undersöka glykosomalt pH i det livsstadiet.

I denna studie har vi använt den fluorescerande proteinbiosensorn pHluorin2 för att övervaka glykosomal pH-förändring i BSF T. brucei som svar på miljösignaler inklusive glukossvält⁹ (Figur 1). Resultat från detta arbete tyder på att BSF T. brucei försurar glykosomer snabbt som svar på svält på ett reversibelt sätt, liknande svar som vi har observerat hos PF-parasiter. Vi förväntar oss att denna biosensor kommer att förbättra vår förståelse för glykolytisk reglering i T. brucei och besläktade parasiter.

Användning av T. brucei brucei 90-13 BSF-trypanosomer, en monomorf parasitlinje, kräver hänsyn till säkerheten eftersom de anses vara riskgrupp 2-organismer som bör hanteras i anläggningar med biosäkerhetsnivå 2.

1. Trypanosomodling och transfektion

1. Odling T. brucei brucei 90-13 BSF trypanosomer i HMI-9 medium kompletterat med 10 % värmeinaktiverat FBS och 10 % Nu-Serum vid 37 °C i 5 % CO₂¹⁰.
   OBS: För att hålla kulturen frisk, håll celltätheten mellan 2 × 10⁴ och 5 × 10⁶ celler/ml.
2. Kloning av pHluorin2-PTS1 till pLEW100v5
   1. Syntetisera pHluorin2 öppna läsramen kommersiellt för att ge genen med en 3'-förlängning som kodar för en två glycinlänkar följt av tripeptiden AKL, en PTS1-lokaliseringstagg.
   2. Klona den här konstruktionen till den inducerbara trypanosomuttrycksvektorn pLEW100v5 genom restriktionssammandrag. Dubbeldigest både kloningsvektorn som innehåller pHluorin2-PTS1 och pLEW100v5 med hjälp av HindIII och BamHI¹¹. Utför ett rengöringssteg, helst genom rening av agarosgel, för att avlägsna restriktionsenzymer, den oönskade kloningsvektorryggraden och det bortskurna fragmentet av luciferasgenen.
   3. Ligate den pHluorin2-bärande insatsen i smält pLEW100v5 med T4 DNA-ligas¹². (Se kompletterande figur S1 för ett schema för kloning).
3. Sekvensera plasmiden genom nästa generations helplasmidsekvensering för att verifiera att insatsen och vektorn ligeras korrekt och att inga mutationer introduceras i pHluorin2-PTS1-genen under kloningsprocessen.
   OBS: Den fullständiga plasmidsekvensen har skickats till Addgene.org och har tilldelats #83680.
4. Linjärisera 20 μg av plasmiden genom att smälta med 40 enheter NotI. transfekt sedan till BSF 90-13-parasiter via nukleofektion med hjälp av det refererade humana T-cellskitet (se materialförteckning). Välj för stabil integration enligt beskrivningen av Burkard et ^al.13.

2. Immunofluorescenssamlokalisering av pHlourin2-PTS1

1. Förbered objektglas genom att behandla dem med poly-L-lysin 0,1 % (vikt/v) i H₂O i 10 min. Efter avlägsnande av poly-L-lysinlösningen, tvätta objektglaset en gång med PBS.
2. För att inducera pHluorin2-PTS1-uttryck, behandla celler vid 2 × 10⁵ celler/ml med tetracyklin eller doxycyklin (1 μg/ml) 24 timmar före skörd. Pellet 2 × 10⁶ föräldra- och inducerade pLEWpHluorin2-PTS1 (pHL) parasiter genom centrifugering (rumstemperatur [RT], 10 min, 1 000 × g) och tvätta en gång med PBS.
3. Återsuspendera cellerna i 200 μl nyberedd 2 % paraformaldehyd i PBS tillverkad av kommersiellt levererad 16 % EM-lösning. Applicera cellerna i fixeringsmedlet på objektglaset och låt cellerna sätta sig i 30 minuter. Tvätta de vidhäftade cellerna 2 gånger med tvättlösning (0,1 % normalt getserum i PBS).
4. Applicera permeabiliseringslösningen (0,5 % Triton X-100 i PBS) på cellerna och inkubera i exakt 30 minuter. Ta bort permeabiliseringslösningen och tvätta en gång med rikliga mängder tvättlösning.
5. Applicera blocklösningen (10 % normalt getserum och 0,1 % Triton X-100 i PBS) och inkubera i 30 minuter.
6. Späd antiserumet mot T. brucei aldolase 1:500 i blocklösning och applicera det på cellerna¹⁴. Inkubera i 1 h vid RT. Tvätta objektglasen 5 gånger i 3-5 min min med tvättlösning.
7. Späd get anti-rabbit Alexa fluor 568 1:1,000 i blocklösning och applicera på cellerna. Inkubera i 1 h vid RT. Tvätta objektglasen 5 gånger i 3-5 min med tvättlösning.
8. Applicera monteringsmedium och försegla ett täckglas på objektglaset.
9. Avbilda cellerna med ett 100x objektiv (NA 1,4-0,7) och analysera bilderna med hjälp av ImageJ. Utför Pearsons samlokaliseringsanalys med hjälp av plugin-programmet "Coloc 2" för ImageJ. Se kompletterande figur S2 för ett fält av representativa celler. )
   1. För att slutföra detta lägger du till bildfilen i Fiji och väljer Bilder.
   2. Justera ljusstyrka och kontrast för varje kanal till en punkt där ingen bakgrund är synlig.
   3. Ändra bilder från 16-bitars till 8-bitars, sammanfoga bilderna och beskär sedan till en enda cell med delade kanaler.
   4. Under Analysera och samlokalisera väljer du plugin-programmet Coloc2. Välj aldolase (den röda kanalen) som kanal 1 och pHL (den gröna kanalen) som kanal 2 och klicka på OK för att initiera beräkningen av Pearsons korrelation.

3. Provberedning för flödescytometri

1. Inducera pHL-celler med antingen tetracyklin eller doxycyklin (1 μg/ml) över natten.
2. Pelletera cellerna (~4 × 10⁷ pHL och ~1 × 10⁶ parental) genom centrifugering (RT, 10 min, 1 000 × g). Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml PBS antingen med eller utan 10 mM glukos beroende på om provet är utsvultet eller osvultet. För tidsförloppsanalyser, resuspendera i PBS kompletterat med 10 mM glukos för att förhindra att cellerna svälter tills tvättarna är klara. För HTS-analysen (High-Throughput Screen), återsuspendera i PBS utan glukos för att minimera överföring av glukos; Upprepa tvättarna två gånger till.
3. Centrifugera cellerna en fjärde gång, ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i antingen PBS, PBS plus 5 mM glukos eller PBS plus 10 mM glukos beroende på behandlingen. Komplettera proverna med antingen 1 μg/ml propidiumjodid (PI) eller 100 nM tiazolrött (TR) för bestämning av levande/död. Överför varje sample till 5 ml rör som är kompatibla med flödescytometern.

4. Flödescytometri

OBS: Förbered experimentet på en flödescytometer som innehåller följande lasrar: 405 nm (violett), 488 nm (blå) och 561 nm (gul) eller 638 nm (röd). Se kompletterande tabell S1 för vanliga namn för kanaler som diskuteras nedan.

1. För att mäta pHL-fluorescens, använd kanalerna KO525 (VL2-H, excitation 405 nm, emission 542/27 nm) och FITC (BL1-H, excitation 488 nm, emission 530/30 nm). För att skilja levande celler från döda celler, använd antingen PI eller TR; mät PI på YL2-H-kanalen (excitation 561 nm, emission 620/25 nm). Mät TR på RL1-H-kanalen (638 nm excitation, 660/10 BP).
   1. För att ställa in experimentet på flödescytometerprogramvaran, skapa följande diagram: 1) YL2-H-kanalhistogram (om du använder PI) eller ett RL1-H-kanalhistogram (om du använder TR), 2) FSC-A vs SSC-A punktdiagram, 3) FSC-A vs FSC-H punktdiagram och 4) BL1-H vs VL2-H kanalpunktdiagram.
   2. Placera den ofärgade WT-kontrollen (föräldracellinje) på sample injektionsport (SIP) först och höj stage på plats. Börja samla in data på cytometern vid den lägsta flödeshastigheten för att ge tid att göra nödvändiga justeringar. För att undvika att poängsätta falskt skräp och döda celler, börja registrera händelser 5 s efter att sample insamling börjar.
   3. Justera YL2- eller RL1-spänningen så att huvudtoppen ligger inom 10 3-10 ⁴ enheter för relativ fluorescensintensitet (RFI). Justera FSC- och SSC-spänningarna så att >90 % av händelserna får plats i punktdiagrammet. Justera FSC-tröskeln för att utesluta skräppopulationen men inte sannolika celler.
   4. Justera VL2- och BL1-kanalerna så att den primära toppen ligger inom 10^{3-10 4} RFI-enheter för den ofärgade WT-kontrollen.
   5. Placera det första provet som innehåller inducerad pHL färgad med antingen PI eller TR på SIP och höj stage på plats. Börja samla in data med lägsta flödeshastighet och observera noggrant händelser i varje diagram. Se till >90 % av händelserna finns inom varje diagram och att inga händelser mättar VL2-H- och BL1-H-kanalerna.
2. Fortsätt med att köra exemplen. Se till att registrera minst 10 000 händelser per exempel.
3. Spara data från exemplen i .fcs-filformat och exportera för analys.

5. Dataanalys av flödescytometriresultat

OBS: Detta arbetsflöde för dataanalys använder FlowJo-programvara. Om annan programvara för flödescytometrianalys används, fortsätt att följa de viktigaste stegen som beskrivs nedan med hjälp av programvaruanpassade verktyg. För att visualisera diagrammen och gating, se kompletterande figur S3 och kompletterande figur S4.

1. Öppna en ny layout och öppna FCS-filerna som hämtades i steg 4.3. Dra och släpp .fcs-filerna i layoutfönstret.
2. Grind för levande celler.
   1. Dubbelklicka på den ofärgade WT-kontrollen för att öppna ett fönster för det här exemplet.
   2. Visa data som ett histogram på antingen YL2-H-kanalen (om du använder PI) eller RL2-H (om du använder TR). Växla mellan detta och prover färgade med livskraftsfärgämnet för att identifiera levande och döda populationer.
      OBS: Alla händelser bör vara ofärgade eftersom ett livskraftsfärgämne inte tillsattes till detta prov.
   3. Skapa en bisektrisport som delar upp den levande och den döda befolkningen. namnge den vänstra porten Live och den högra porten Dead. Tillämpa den här grinden på alla prover och växla sedan mellan proverna för att säkerställa att den här grinden ritas på rätt sätt för alla prover. Justera grinden efter behov.
3. Grind för cellerna.
   1. På den ofärgade WT-kontrollen dubbelklickar du på Live-grinden för att se händelser i den grinden. Ändra punktdiagrammets x-axel till FSC-A och y-axeln till SSC-A.
   2. Använd polygongrindverktyget för att rita en grind runt cellpopulationen och ge den namnet Celler. Var noga med att utesluta skräp/döende celler (vanligtvis längst till vänster och längst ned i punktdiagrammet) och aggregeringar (längst till höger och högst upp i punktdiagrammet).
   3. Använd den här grinden under Live-grinden för alla exempel. Växla mellan prover för att säkerställa att grinden omfattar den sannolika cellpopulationen för alla prover och gör nödvändiga justeringar. Var noga med att applicera grinden på alla prover igen efter att du har ändrat den.
      OBS: Cellpopulationsfördelningen förändras märkbart mellan svältande och icke-svältande förhållanden på FSC vs SSC; se till att cellgrinden omfattar cellpopulationen under alla förhållanden.
4. Grind för enskilda celler för att öka kvaliteten på pH-mätningar.
   1. På den ofärgade WT-kontrollen dubbelklickar du på cellporten för att visa händelser i den porten. Ändra punktdiagrammets x-axel till FSC-A och y-axeln till FSC-H.
   2. Leta efter en diagonal fördelning av enskilda celler i detta punktdiagram med dubbletter som bildar en sekundär population längst ned till höger om singlettpopulationen (se kompletterande figur S1 tredje diagrammet). Med hjälp av polygongrindverktyget ritar du en grind runt singlethändelserna exklusive dubblettpopulationen. Döp den här grinden till Singlets.
   3. Använd Singlets-grinden under Cell-grinden för alla samples. Växla återigen mellan exempel för att säkerställa att grinden korrekt exkluderar dubblettpopulationen samtidigt som singlettpopulationen inkluderas. Justera efter behov.
5. Grind för fluorescerande pHL-celler.
   1. På det ofärgade WT-kontrollprovet dubbelklickar du på Singlets-porten för att öppna ett punktdiagram för den populationen. Ändra x-axeln till BL1-H och y-axeln till VL2-H.
   2. pH-sensorn pHluorin2 är fluorescerande i både VL2 och BL1. Använd verktyget polygongrind för att rita en diagonal grind som sträcker sig uppåt och åt höger bort från den autofluorescerande populationen längst ned till vänster i punktdiagrammet. Ge den här grinden namnet pHL+.
   3. Applicera pHL+ -grinden under Singlets-grinden för alla samples. Växla till ett pHL-prov och justera grinden så att den inkluderar händelser med högre fluorescensintensitet i både VL2-H och BL1-H än WT-kontrollen. Se till att denna grind omfattar denna fluorescerande population för alla samples eftersom positionen för denna population kommer att förskjutas när glykosomalt pH ändras.
      OBS: Denna lilla men synliga förändring i pHL+-populationen beror på pH-beroende förändringar i fluoroforens excitationsspektrum.
6. Exportera statistiken.
   1. Klicka på Tabellredigeraren | Redigera fält | Lägg till kolumn för att lägga till ny statistik som ska exporteras.
      OBS: För varje statistik som ska exporteras väljer du respektive statistik och vilken population du vill exportera den från. Se till att välja lämplig parameter för tillämplig statistik, till exempel Median. Lämna provet oförändrat.
   2. Lägg till kolumner med följande statistik: Totalt (oskyddat) antal, pHL+-antal, livefrekvens av totalt (procent baserat på totalt antal händelser), pHL+ frekvens av förälder (procent baserat på överordnad grind), pHL+ Medianvärde VL2-H och pHL+ medianvärde BL1-H.
   3. Klicka på tabellredigeraren och ändra följande exportinställningar: Visa till fil och Text till CSV och välj sedan fildestination och namn. Klicka på Skapa tabell.
7. Beräkna fluorescensförhållandet.
   1. Spara den exporterade .csv filen som en kalkylbladsfil.
   2. Utför kvalitetskontrollanalys genom att jämföra följande för alla exempel i experimentet: antal händelser per exempel, procentandel livehändelser och procentandel pHL+-händelser. Jämför dessa visuellt i stapel- eller punktdiagram beroende på experimentet.
   3. Märk en ny kolumn som pHL+ Median VL2/BL1. För varje prov, dividera medianvärdet för VL2-H med medianvärdet för BL1-H som visas i ekvation (1).
      Nej (1)
8. Använd programvara för statistisk analys för att utföra statistisk analys med hjälp av fluorescensförhållandet.

6. Kalibrering av pH-biosensor

OBS: För att konvertera uppmätta fluorescensförhållanden till pH-enheter, kalibrera pHL-uttryckande celler med nigericin och valinomycin. Nigericin är en K⁺/H⁺ antiporter, en jonofor som kan utjämna pH över membran när det finns tillräckligt med K⁺ i bufferten¹⁵. Nigericin har ofta använts för att kalibrera pHluorin och andra pH-sensorer ^16,17. Eftersom peroxisomalt lokaliserat pHluorin tidigare kalibrerats med 10 μM nigericin¹⁸ valde vi att behandla med den koncentrationen. Valinomycin är en kaliumjonofor och har använts (vid 4 μM) för att utjämna pH över mitokondriella membran¹⁹. Vi använde 10 μM valinomycin för att hjälpa nigericins pH-jämviktsaktivitet genom att säkerställa att K+-joner var i jämvikt över membranen. Medan vi använde en kombination av nigericin och valinomycin, kan nigericin vara tillräckligt för att utjämna organellärt pH.

1. Bered åtta lösningar av universell kalibreringsbuffert (UCB; 15 mM MES, 15 mM HEPES och 130 mM KCl) var och en vid olika pH från 5 till 8,5.
2. Centrifugera (RT, 10 min, 800-1 000 × g) åtta separata rör med 2 ml pHL-uttryckande BSF-kultur (~4 × 10⁶ celler vardera).
3. Ta bort supernatanten och återsuspendera sedan varje cellpellet i UCB vid olika pH-värden.
4. Introducera nigericin och valinomycin vardera till 10 μM. Ökning av PI till 1 μg/ml.
5. Inkubera cellerna i varje lösning i 15 minuter.
6. Kör varje sample på en flödescytometer för att mäta fluorescensförhållandet enligt beskrivningen i steg 4-5.
7. Upprepa detta experiment ytterligare två gånger för att få tre biologiska replikat för varje pH-värde. Exportera data i .fcs-format.
8. Analysera .fcs-filerna enligt beskrivningen i steg 5.1 till 5.8. Använd det uppmätta fluorescensförhållandet för varje pH för att interpolera glykosomalt pH i framtida experiment med ekvation (2).
   (2)
   OBS: Kompletterande figur S3 visar punktdiagram och grindschema. Resultaten finns i tilläggstabell S2. Följande beskriver hur man interpolerar pH från fluorescensförhållande med hjälp av GraphPad Prism. Om du använder annan statistisk programvara, följ samma viktiga steg.
   1. Öppna GraphPad Prism och skapa en XY-tabell med tre y-replikat. Klistra in pH-värdena i x-kolumnen och deras associerade fluorescenskvotvärden i y-replikatkolumnerna.
   2. Klicka på grafen som är kopplad till tabellen. När du visar diagrammet klickar du på Analysera under menyfliksområdet Analys | Interpolera en standardkurva under XY-analyser.
   3. Välj Sigmoidal, 4PL, X är log (koncentration) eftersom pH-enheter är på en logaritmisk skala. Topp- och bottenparametrarna är de uppskattade topp- och bottenplatåerna. Välj Ingen särskild hantering av extremvärden.
      OBS: Programvaran kommer att försöka anpassa data till modellen som beskrivs i ekvation (2) och steg 6.9.3. Leta efter tecken på bristande passform i resultattabellen och kurvan i diagrammet.
   4. För att interpolera pH från fluorescensförhållanden i andra experiment, gå till tabellen med pHL-kalibreringsdata. Klistra in värdena för fluorescensförhållandet under kalibreringsdata i y-kolumnen/y-kolumnerna. Ge varje y-värde en rubrik men lämna x-värdet (pH-värdet) tomt eftersom det är okänt.
   5. I resultatgalleriet klickar du på interpolationsanalysen och går sedan till fliken Interpolerade X-repliker. Leta efter de interpolerade pH-värdena som kommer att listas tillsammans med de angivna fluorescensförhållandena.
      OBS: Programvaran använder modellen och de bäst anpassade parametervärdena som finns från kalibreringsdata för att interpolera pH från fluorescensförhållanden för experiment där pH är okänt.

7. Glukossvält och tidsförlopp för återgång

1. Inducera 15 ml BSF pHL-parasiter över natten med 1 μg/ml doxycyklin inkuberat vid 37 °C enligt beskrivningen i steg 1.1.
2. Tvätta 15 ml inducerad pHL-kultur i PBS kompletterat med 10 mM glukos. Upprepa detta steg 3 gånger.
   1. Tvätta samtidigt 3 ml WT-kultur i PBS 3x enligt beskrivningen i steg 3.2.
   2. Efter den första tvätten, när pHL-provet återsuspenderas i 1 ml PBS, avlägsnas en 0,1 ml alikvot av pHL-cellsuspensionen för att hålla kvar 10 mM glukos som en icke-svältande kontroll.
3. Efter den sista tvätten återsuspenderas pHL-provet i PBS kompletterat med 1 μg/ml PI.
4. Hämta flödescytometridata
   1. Börja övervaka glykosomalt pH för både de svältande och icke-svältande proverna genom att mäta varje prov på en flödescytometer var 5:e, 10:e, 30:e eller 90:e minut, beroende på experimentet och provet. Skaffa flödescytometridata enligt beskrivningen i steg 4.1 till 4.3 och se till att spänningarna och diagrammen förbereds i förväg.
   2. Kör den ofärgade WT-kontrollen först vid 0 min.
   3. Kör det osvultna kontrollprovet på cytometern var 90:e minut med början vid 0 minuter. För Starvation time-course analys, kör det svältande sample var 10:e minut med början vid 0 min. För Glucose Addback-analysen, kör det svältande provet vid 0, 5, 10, 20, 30, 60 och 90 min; Upprepa sedan efter att ha tillsatt glukos.
   4. Inkubera proverna i rumstemperatur under 90 minuters svälttidsförlopp och 180 minuters glukosaddback-tidsförlopp.
5. Analysera .fcs-filerna enligt beskrivningen i steg 5.1 till 5.8.
   OBS: Kompletterande figur S4 visar hur man utför grinden och hur punktdiagrammen ska se ut. Tilläggstabell S3 och tilläggstabell S4 visar resultaten av analysen av glukossvältens förlopp respektive glukosadderingstidsanalysen.

8. Optimering av analysen för läkemedelsscreening

1. Tvätta cirka 32 ml pHL-uttryckande BSF-parasiter och 3 ml WT-celler, båda vid cirka 2 × 10⁶ celler/ml, 2x i PBS som beskrivits tidigare.
   Mer än 10 000 händelser måste registreras per brunn för att minimera variabiliteten i uppmätta fluorescensförhållanden och noggrant mäta Z-faktorstatistiken. Den minsta kultur som krävs för att åstadkomma detta är cirka 26 ml, men vi rekommenderar 32 ml för enkel hantering.
   1. Efter den första tvätten, separera pHL-provet lika i två mikrocentrifugrör.
2. Efter tvättarna, återsuspendera ett pHL-prov i 18 ml PBS innehållande 5 mM glukos, 0,1 % DMSO och TR. Återsuspendera det andra pHL-provet i 18 ml PBS plus 0,1 % DMSO och TR.
   OBS: DMSO används för att efterlikna buffertsammansättningen i en läkemedelsskärm eftersom föreningar vanligtvis löses upp i DMSO.
3. Överför dessa två celllösningar till en 12-brunnsreservoar, 9 ml per brunn.
4. Använd en pipetteringsrobot för att pipettera celllösningarna i separata halvor av en 384-hålsplatta, 80 μL per brunn.
5. Inkubera plattan i rumstemperatur i 1,5 timme, skaka försiktigt och linda in den i aluminiumfolie för att skydda fluoroforerna från ljus.
6. Kör plattan på en flödescytometer som kan köra plattor med 384 brunnar.
   OBS: Följande arbetsflöde är anpassat till en Attune NxT med Cytkick Max Auto Sampler. Om en annan flödescytometer används, fortsätt att följa de viktigaste stegen.
   1. För plattan, kör med den snabbaste flödeshastigheten (1 000 uL/min) och aktivera boost-läge. Skaffa 20 μL/brunn. Inkludera en blandningscykel och en sköljcykel mellan varje brunn.
   2. Skapa diagram enligt beskrivningen i steg 4.1.3.
   3. Kör en ofärgad WT-rörkontroll och optimera voltages enligt beskrivningen i steg 4.1.3 och 4.1.4. Kör ett utsvultet pHL-rörprov och optimera VL2- och BL1-spänningarna enligt beskrivningen i steg 4.1.
   4. Börja ta plattan på flödescytometern. Kör plattan horisontellt så att det inte finns någon signifikant förvärvstidsskillnad mellan de svältande och osvultna provbrunnarna. Se till att plåtinsamlingen är klar på ~1.5 timmar.
7. Exportera .fcs-filerna och analysera data enligt beskrivningen i steg 5.1 till 5.8. Hitta medelvärdet (AVG) och standardavvikelsen (SD) för fluorescensförhållandena för proverna som behandlats med antingen glukos (Glc) eller ingen glukos (svält).
   OBS: Data från våra Z-faktorexperiment finns i tilläggstabell S5.
8. Beräkna Z-faktor^{20-statistiken} med hjälp av ekvation (3).
   Nej (3)

Figur 1: Diagram över metoden för att klassificera glykosomalt pH i levande BSF-trypanosomer. (A) Avbildning av cellinjer som uttrycker glykosomalt belägen pHluorin2-sensor. Införandet av en peroxisomal målsekvens ger kontroll över lokaliseringen. OBS: Vi förväntar oss att eliminering av PTS-1 skulle leda till cytosolisk lokalisering, vilket möjliggör framtida analys av pH i det subcellulära facket. B) Beskrivning av sensorvalideringstestet. Förkortning: BSF = blodomloppsform. Klicka här för att se en större version av denna figur.

OBS: Z-faktorstatistiken används för att avgöra hur lämplig en analys är för HTS. Värden mellan 0,5 och 1,0 betyder i allmänhet att analyskvaliteten är acceptabel för HTS.

pHLuorin2-PTS1 lokalisering till glykosomer i BSF T. brucei
För att bedöma den subcellulära lokaliseringen av pHluorin2-PTS1 utsattes parasiterna för immunofluorescensanalyser. Signal från transgenen samlokaliserad med antiserum upphöjd mot ett glykosomresidentt protein, aldolas (TbAldolase) (Figur 2A). Den genomsnittliga Pearsons korrelationskoefficient för samlokalisering mellan anti-TbAldolase och pHluorin2-PTS1 var 0,895, vilket indikerar att pHluorin2-PTS1 primärt var lokaliserat till glykosomer. Med pHluorin2-PTS1 lokaliserat till glykosomen fortsatte vi att undersöka BF-glykosomens pH.

Figur 2: Lokalisering av pHluorin2-PTS1 till glykosomer i BSF Trypanosoma brucei. (A) Samlokalisering av pHluorin2-PTS1 med det glykosomalt residenta proteinet TbAldolase. BF 90-13-parasiter transfekterades med pLEWpHluorin2-PTS1 och expression inducerades med doxycyklin (1 μg/ml). TbAldolase lokaliserades med hjälp av anti-TbAldolasserum, följt av inkubation med get-anti-kanin Alexa fluor 568. Den genomsnittliga Pearsons korrelationskoefficient var 0,895 (30 celler). (B) Kalibrering av pHluorin2-PTS1 i BSF T. brucei. Skalstaplar = 4 μm. Förkortning: BSF = blodomloppsform. Klicka här för att se en större version av denna figur.

pHluorin2-PTS1 kalibrering
Förändringar i pH förändrar excitationsspektrumet för pHluorin2-PTS1. Under neutralt pH är pHluorin2-PTS1-excitationen vid 405 nm större än vid 488 nm; när pH sjunker är det omvända^{sant 9,21}. För att mäta glykosomens relativa pH med flödescytometri mätte vi emission när den exciterades av 405 nm-lasern (VL2-kanal) och emission när den exciterades av 488 nm-lasern (BL1-kanal), med hjälp av förhållandet VL2/BL1 (fluorescensförhållande) för att mäta det relativa glykosomala pH-värdet. För att omvandla fluorescensförhållandet till pH utjämnade vi intracellulärt och glykosomalt pH med extracellulärt pH med hjälp av jonoforerna valinomycin och nigericin^17,18 följt av flödescytometrianalys för att hitta fluorescensförhållandet. Som förväntat ökade fluorescenskvoten när extracellulärt pH ökade med ett intracellulärt K_d på pH 6,5 (Figur 2B). Detta K_d var något lägre än det rapporterade K_{d för} pHluorin in vitro ^{2 9}. Intressant nog var BSF-glykosomalt pH i närvaro av glukos ~pH 8,0, vilket var mer basiskt än PF-glykosomer i närvaro av glukos²². Vi använde denna kalibreringskurva för att omvandla fluorescensförhållandet till pH i efterföljande experiment.

Glykosomförsurning på grund av glukossvält
Medan T. brucei PF-parasiter försurar sina glykosomer när de svälter på glukos²², är det okänt hur BSF-glykosomer svarar på glukos. För att utforska detta tvättade vi BSF-parasiter som uttryckte pHluorin2-PTS1 i PBS plus 10 mM glukos för att ta bort odlingsmediet och återsuspenderade sedan cellerna i PBS utan glukos. Sensorns respons på denna störning mättes omedelbart och därefter var 10:e minut under 1,5 timme med flödescytometri. Svaren jämfördes med celler i PBS plus 10 mM glukos (osvultna).

Som svar på svält observerade vi en gradvis mild försurning över tid, som planade ut med ~90 minuter (Figur 3A). Denna förändring i glykosomalt pH var statistiskt signifikant (p < 0,0001) och repeterbar i tre separata experiment. Detta tyder på att BSF-celler milt försurar sina glykosomer när de svälter på glukos, liknande det svar som observerats i PF-livsstadium⁹.

Figur 3: Reversibel surgörning av glykosomer av BSF T. brucei vid berövad glukos. A) Glykosomalt pH i celler som odlats i frånvaro (svältande, blå) eller närvaro (osvält, röd) av glukos. De svältande cellerna återsuspenderades i PBS utan glukos ~2 minuter före den första mätningen på en Attune NxT flödescytometer. Tre biologiska replikat av tidsförloppet utfördes. Osvultna parasiter inkuberades i PBS plus 10 mM glukos. Ett oparat tvåsidigt studenttest utfördes som jämförde de utsvultna och de osvultna 90 minuterna, ***p = 0,0001. (B) Tidsförlopp för glykosomal pH-förändring svältande (blå) och osvultna (röda) BSF-parasiter med 10 mM glukos återinförd vid 90 minuter (grön streckad linje). Fem biologiska replikat av tidsförloppet utfördes. NS = inte signifikant (p = 0,25, oparat tvåsidigt studentens t-test). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Reversibel glykosomal försurning som svar på glukos
Därefter testade vi om BSF-glykosomförsurningen var reversibel genom att svälta cellerna och sedan återinföra glukos. Parasiter inkuberades i frånvaro av glukos i 90 minuter. Glukos (10 mM) tillsattes sedan och sensorsvaret mättes med cytometri i ytterligare 90 minuter (Figur 3B). Vi observerade att efter att glukos återinfördes återgick glykosomalt pH till nivåerna före svält på ~30 minuter. Dessa resultat tyder på att BSF-glykosomalt pH är dynamiskt och reglerbart som svar på glukos, liknande det pH-svar som observerats hos PF-parasiter.

Anpassning av pHluorin2-analysen för läkemedelsscreening med hög kapacitet
Glykosomer är viktiga organeller för trypanosomen, eftersom de har viktiga metaboliska vägar. Glykosomernas betydelse tyder på att hämmare av deras homeostas kan vara lovande som potentiella terapeutiska ledtrådar. Här har vi anpassat analysen för glykosomalt pH till ett high-throughput-format, vilket kommer att möjliggöra anpassning till läkemedelsscreening för att identifiera hämmare av glykosomalt pH. Vi förväntar oss att störningar i regleringen av detta svar kan vara skadliga för parasiten, med tanke på den kända effekten av pH på glykosomresidenta proteinfunktioner⁷.

För att fastställa formatet med hög genomströmning poängsatte vi analysens robusthet. För att fullborda detta pläterades parasiter inducerade för att uttrycka pHluorin2-PTS1 i en 384-brunnars mikrotiterplatta i antingen 5 mM glukos (höga kontroller) eller ingen glukos (låga kontroller) och inkuberades sedan i 90 minuter vid rumstemperatur. Plattan analyserades sedan med flödescytometri. Som framgår av figur 4 var variationen mellan replikatmätningarna låg och de höga och låga kontrollerna är väl separerade, egenskaper som resulterade i en acceptabel Z-faktor på 0,645. Analyser med värden > 0,5 anses i allmänhet vara tillräckligt robusta för anpassning till screeningkampanjer med hög genomströmning. Med tanke på framgångarna här förväntar vi oss att denna sensor och detta tillvägagångssätt kommer att användas i framtida läkemedelsscreeningar med hög kapacitet.

Figur 4: Analys för att bedöma lämpligheten hos pHluorin2-PTS1 sensorbärande BSF för framtida HTS-kampanjer. Cellerna inkuberades i 90 minuter med glukos (hög kontroll, röd, 5 mM glukos) eller utan hexos (låg kontroll, blå, ingen extra glukos). Den beräknade Z-faktorn var 0,645. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur S1: Kloning av pHluorin2-PTS1-genen till den inducerbara T. brucei-uttrycksvektorn pLEW100v5. (A) Båda vektorerna var dubbelrestriktion, upplästes av HindIII och BamHI och renades sedan. Genfragmentet pHluorin2-PTS1 ligerades till pLEW100v5 med hjälp av T4 DNA-ligas. (B) pLEW100-pHlourin2-PTS1. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S2: Samlokalisering av pHL med TbAldolase BF 90-13-parasiter transfekterade med pLEWpHluorin2-PTS1. Uttrycket inducerades med doxycyklin (1 μg/ml). TbAldolase lokaliserades med hjälp av anti-TbAldolase serum (utspätt 1:500 i block), följt av inkubation med get anG-rabbit Alexa fluor 568. Den genomsnittliga Pearsons korrelationskoefficient var 0,895 (30 celler). Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S3: Representativa gating- och punktdiagram för kalibrering av BSF pHL-sensorcellinje med pH 8-kalibreringsbuffertprovet som exempel. Proverna färgades med viabilitetsfärgämnet PI för att bedöma hur pH påverkade viabiliteten med hjälp av YL2-H-kanalen, men viabilitet användes inte i grindschemat. En bred grind på FSC-A vs SSC-A användes för att grinda för celler eftersom både levande och döda celler användes i kalibreringen. Efter grind för celler var enstaka celler (singlets) gated med FSC-A vs FSC-H. Slutligen användes en strikt grind för händelser fluorescerande för pHL i BL1-H- och VL2-H-kanalerna. Förkortningar: BSF = blodomloppsform; PI = propidiumjodid; FSC-A = främre spridningstoppsarea; SSC-A = sidospridningstoppsarea; FSC-H = spridningstoppens höjd framåt. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S4: Representativa gating- och punktdiagram för glukossvält och add-back-tidsförloppsanalyser. Exemplet Starved 0 min används som exempel. Levande celler var inlåsta på YL2-H-kanalen eftersom PI användes. Cellerna inhägnades med FSC-A jämfört med SSC-A för att utesluta skräp och aggregat. Linnen var inhägnade med FSC-A vs FSC-H. Kanalerna BL1-H och VL2-H användes för att grinda för pHL+-händelser. En WT-kontroll användes för att utesluta autofluorescerande händelser när denna grind ställdes in. Förkortningar: PI = propidiumjodid; FSC-A = främre spridningstoppsarea; SSC-A = sidospridningstoppsarea. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggstabell S1: Kanal och trivialnamn som används för flödescytometri. Kanalnamnet, det vanliga namnet och det laser- och emissionsfilter som används tillhandahålls. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell S2: Resultat från pHL-kalibrering med nigericin och valinomycin i olika pH-buffertar. Den här tabellen innehåller exporterad statistik från FlowJo-analysen av .fcs-filerna. Dessa värden användes för att hitta fluorescensförhållandet (VL2-H/BL1-H) för kalibrering av pHL, som visas i figur 2. Dessa pH-kalibreringsresultat användes också för att interpolera pH för experimenten med glukossvält och add-back-tidsförlopp (figur 3). Följande statistik användes för kvalitetskontroll: Totalt antal händelser, antal pHL+, PI- (%), PI+ (%) och pHL+ (%). Data för varje biologisk replikat finns i en separat flik, och fliken märkt "Sammanfattade resultat" innehåller fluorescensförhållandena för varje pH-behandling och replikat. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell S3: Analyserade data från BSF pHL-glukossvältanalys som presenteras i figur 3A. Den här tabellen innehåller exporterad statistik från .fcs-filer som analyserats i FlowJo-programvaran. Fluorescenskvoterna beräknades genom att ta förhållandet mellan medianvärdet för VL2-H och medianvärdet för BL1-H (båda från pHL+-populationen). Dessa nyckeltal sammanställdes under fliken "Sammanfattade resultat". PI- (%) användes för att bestämma effekten av glukossvält på livskraften över tid. Totalt antal och pHL+-antal användes för kvalitetskontroll. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggstabell S4: Analyserade data från BSF pHL glukosadd-back time-course assay som presenteras i figur 3B. Den här tabellen innehåller exporterad statistik från .fcs-filer som analyserats i FlowJo-programvaran. Medianvärdena för pHL+ VL2/BL1 beräknades från medianvärdena för pHL+ VL2-H och BL1-H i Excel. Den övriga statistiken användes för kvalitetskontroll. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell S5: Resulterande data från FlowJo-analys av Z-Factor-studiens screeninganalys med hög genomströmning med pHL. Flikar märkta "0 mM glukos" (låg) och "5 mM glukos" (hög) innehåller data från celler som behandlats med 0 respektive 5 mM glukos. Dessa fluorescensförhållanden presenteras i figur 4. På fliken "Poolad analys" sammanställdes fluorescensförhållandena för båda behandlingarna och medelvärdet och standardavvikelsen för provet (SD) beräknades för var och en. Z-faktorstatistiken beräknades med hjälp av ekvation 3. Förhållandet mellan medelvärdet Högt/Lågt beräknades för att mäta separationen av medelvärdena. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Förståelsen av miljöperception och responsmekanismer i den afrikanska trypanosomen är dåligt förstådd. Förändringar i näringstillgången är kända för att utlösa olika reaktioner hos parasiten, inklusive försurning av glykosomer. Här har vi beskrivit en metod för att studera glykosomalt pH-svar på miljöstörningar i levande celler med hjälp av en ärftlig proteinsensor, pHluorin2, och flödescytometri.

Det finns flera kritiska steg i användningen av sensorn. För det första är karakteriseringen av transfekterade parasiter som uttrycker transgenen viktig, eftersom det kan finnas cell-till-cell-variation i uttrycket. Uttrycksnivåerna för vissa transgener kan sjunka med tiden. Även om detta inte har observerats med de pHluorin2-bärande cellerna hittills, om sensorns respons blir mycket varierande (t.ex. efter induktion är sensorsignalen inte robust), kan det vara nödvändigt att klona bort kulturen, eftersom vissa medlemmar av befolkningen kan uttrycka proteinet på högre nivåer än andra. Alternativt har retransformation och selektion visat sig vara användbart för att generera nya cellinjer med högre (om än möjligen övergående) uttryck. Om retransfektion krävs rekommenderar vi att man klonar bort enskilda linjer, eftersom uttrycket av den transgen som är av intresse kan ge en subtil tillväxtnackdel som leder till förlust av höga uttryckare i populationen över tid.

Dessutom är det viktigt att övervaka parasiternas livskraft - både under analysen och samtidigt som man rutinmässigt underhåller odlingarna. Vi har inkluderat antingen PI eller tiazolrött för detta ändamål under analysen, och dessa rapportörer säkerställer att data endast återspeglar svar i levande celler. Att säkerställa att cellfördubblingstiden under normal odling är konstant, särskilt före initiering av storskaliga analyser (t.ex. HTS-analyser) begränsar oron för att initiera analyser med celler som inte trivs, vilket skulle kunna förändra höga och låga kontrollsignaler negativt och påverka skärmens övergripande robusthet.

Den metod som vi har beskrivit här för att mäta glykosomalt pH är robust och känslig. Det finns dock begränsningar i tillvägagångssättet. För det första krävs tillgång till cytometrar med lämplig kapacitet, inklusive provtagare som kan ta emot mikrotiterplattor. Ratiometriska data kan samlas in med fluorescensmikroskopi, men det begränsade antalet prover som kan analyseras på det sättet begränsar användbarheten av metoder som skärmar (och tidsförloppsbaserade analyser).

En annan potentiell begränsning är att analyserna involverar ett agens som utgör ett biosäkerhetsproblem. Det är möjligt att de kärnanläggningar som innehåller de instrument som behövs för arbetet inte tillåter levande parasiter på sin utrustning. Dessa begränsningar, tillsammans med de tekniska utmaningarna med att generera och underhålla transgena trypanosomer, kan övervinnas genom samarbete mellan grupper med lämplig expertis inom parasitbiologi och cellanalyser.

Arbetet som beskrivs här fokuserar på att använda den glykosomala pH-sensorn i afrikanska trypanosomer, men verktyget skulle kunna anpassas för användning i andra kinetoplastidparasiter. Även om det är oklart vilken roll försurning av organellen kan ha i biologin hos Leishmania spp. eller Trypanosoma cruzi, är det möjligt att pHLuorin2-PTS1 kan uttryckas som en transgen i cellerna givet att parasitspecifika uttrycksvektorer finns tillgängliga och att det glykosomala importmaskineriet är likartat i organismerna ^5,23,24.

En potentiell tillämpning av de sensorbärande cellerna är identifiering av små molekyler som förändrar cellernas förmåga att försura glykosomen. Dessa skulle sannolikt vara skadliga för parasiten, eftersom förändrat pH har visat sig vara ett möjligt sätt att reglera hexokinas, ett glykosomresidentt protein som är viktigt i det patogena livscykelstadiet av den afrikanska trypanosomen⁷. Analysen som beskrivs här har anpassats för att ha hög genomströmning (figur 4), vilket möjliggör undersökning av stora kemiska samlingar för denna aktivitet.

Sammanfattningsvis erbjuder detta verktyg möjligheten att dissekera mekanismer som är involverade i dynamiska reaktioner i en parasitspecifik organell. Genom att använda sensorlinjerna i kombination med framåt- och bakåtgenetik är det troligt att unika parasitspecifika vägar kommer att identifieras. Dessutom erbjuder sensorlinjerna möjlighet att identifiera småmolekylära hämmare av svaret, vilket öppnar dörren för upptäckt av nya läkemedelsmål.