蚊の微生物群集は、ベクターバイオコントロール戦略に大きな期待を寄せています。ほとんどの共生生物は培養不可能であり、メタゲノム解析が必要です。雌の蚊を解剖し、卵巣、中腸、唾液腺を分離して交差汚染を防ぎ、臓器レベルでのマイクロバイオーム研究を促進し、蚊の生物学における微生物の役割の理解を深める方法について説明します。
マラリア、デング熱、西ナイル熱、ジカ熱、ウストゥ熱、黄熱病など、蚊が媒介する病気の世界的な負担は増加し続けており、公衆衛生上の重大な脅威となっています。殺虫剤耐性の増加と効果的なワクチンの欠如により、蚊の微生物叢に焦点を当てた新しい戦略が出現しています。それにもかかわらず、共生生物の大部分は栽培に抵抗性のままです。したがって、蚊標本における細菌ゲノムの多様性と機能を特徴付けるには、メタゲノミクスとその後のアセンブルおよびビニング戦略に依存しています。分離した臓器からメタゲノム集合ゲノム(MAG)を取得し、解析することで、卵巣(生殖器官)、中腸(食物の消化と免疫の鍵)、または唾液腺(病原体が唾液に入り、血流に到達するためには病原体が媒介性疾患に定着する必要があるため、ベクター媒介性疾患の伝染に不可欠)における蚊に関連する微生物の特定の役割に関する重要な情報を特に提供できます。これらの新たに再構築されたゲノムは、新しいベクターバイオコントロール戦略の開発への道を開くことができる。この目的のためには、蚊の臓器間や他の蚊の臓器に存在する微生物との相互汚染を避けながら、蚊の臓器を隔離する必要があります。ここでは、臓器レベルで蚊のマイクロバイオームを研究するための最適化された汚染のない解剖プロトコルについて説明します。
蚊は、病気の原因となるさまざまな病原体を拡散し、公衆衛生にとって深刻な脅威となっています。蚊の集団における殺虫剤耐性の有病率の増加と、これらの病原体に対する効果的なワクチンがないため、蚊のマイクロバイオームに焦点を当てた新しい生物防除方法が登場しています。特に、病原体の伝播を妨害し、宿主の繁殖を操作する可能性のある細胞内細菌ボルバキアは際立っています1,2,3。さらに、他の蚊の共生生物は、宿主の生存、発達、または免疫系、ならびに病原体の感染と伝染の中心であり、媒介生物が媒介する病気と戦うためのそれらの利用に大きな期待を示しています4,5,6,7,8。
蚊に関連する微生物は、微生物生命のすべての領域(細菌、真核生物、真菌を含む)にまたがり、宿主と密接に相互作用するだけでなく、異なる体区画内で互いに相互作用する9,10。したがって、微生物叢、その潜在的な季節変動11、およびそのメンバーが異なる蚊組織で直接相互作用するメカニズムをよりよく理解することは、新しい標的生物防除方法の開発や既存の方法の改善に役立ちます。しかし、共生生物の大部分は栽培に抵抗性があり、その特性評価は不可能です。
第2世代および第3世代のシーケンシング法の出現は、最先端のアセンブリおよびビニングアプローチとともに、微生物ゲノムの再構築と、培養不可能な微生物の多様性と機能的可能性へのアクセスを可能にしました。ここでは、雌の蚊の卵巣、中腸、および唾液腺を交差汚染を防ぎながら解剖する方法を紹介します。このプロトコルに続いて、ゲノムDNA抽出とそれに続くメタバーコーディングまたはショットガンメタゲノムシーケンシングを行い、臓器レベルでの蚊の微生物叢の多様性と機能を調査することができます。ここでは、 Culex spp.標本の蚊の解剖とマイクロバイオームデータの例を提供しますが、このプロトコルは ハマダラカ や ネッタイシマカなどの他の属のベクターに拡張できます。
唾液腺から始まる臓器解剖の順序に特に注意を払うことをお勧めします。実際、蚊の完全性が保たれていれば、 Culex 標本の胸部から蚊をより簡単に抽出できることを観察しました。腹部や胸部が損傷すると、蚊の体内の圧力が低下し、手順が妨げられる可能性があります。ただし、胸部と腹部の間を切断し、頭と胸部から唾液腺を引き抜くことも可能です(A.B.フェイル、私信)。さらに、熟練した解剖技術を習得するのは難しい場合があるため、実験前に十分な数の標本で練習することをお勧めします。
系統的な方法で交差汚染を回避しながら蚊の臓器を分離することは、下流の蚊の微生物叢の幅広い分析にとって重要です。南フランスのCulex pipiens標本から単一卵巣を解剖した後のゲノム分解メタゲノム研究により、Culex pipiens(pWCP14)におけるボルバキアの最初のプラスミドの発見が可能になりました。同様のアプローチを使用して、世界中の大陸地域と島嶼地域の両方から採取されたCulex pipiensおよびCulex quinquefasciatus標本におけるpWCPの分布と頻度を、さまざまな環境条件および実験室条件で調査しました。全体として、データはCulex蚊に著しく保存されたボルバキアプラスミド要素を明らかにし、この可動性要素が内部共生生物生物学15における重要な役割を果たしていることを示唆しており、さらなる分析が必要です。
ここでは、この体系的な手順を使用して得られた中腸および卵巣サンプルの蚊のマイクロバイオーム分析の追加例を提供します。組織間の微生物叢に明らかな違いが観察され(図5)、共通の細菌分類群と臓器特異的な細菌分類群の両方があることが観察されました。予想通り、 ボルバキア の存在は両方の臓器で検出され、蚊の卵巣のMAGの相対的な存在量(組み立てられていない短い読み取りに基づく)とMAGの平均被覆率は中腸と比較して高く、この内部共生生物が卵巣を介して伝染し、その後体細胞組織に広がるという観察と一致していました。この研究はニューカレドニアからのサンプルに限定されていましたが、このプロトコルは、 ボルバキアの全球規模でのゲノム多様性、およびそれ自体の密度調節やウイルス保護など、さまざまな表現型におけるその役割の研究を促進する可能性があります。さらに、この研究は、ここで紹介する解剖手順が、中腸サンプル内の蚊共生生物の分類学的多様性と潜在的な機能的能力の調査をどのように可能にするかを例示しています。
私たちは、2つの中腸サンプルにのみ存在する2つの腸内細菌ドラフトゲノムを取得し、これら2つの標本の臓器間の汚染がないことを確認しました。スピロヘータに関して、個々の3人の中腸と卵巣の両方で検出された、Jumaと同僚、2020年は、卵いかだの表面にこれらの細菌の存在を観察しました。著者たちは、卵いかだが脱イオン化された細菌を含まない水に保管されていたことを考えると、卵いかだで見つかった細菌群集は主に卵巣から母性遺伝している可能性があるという考えを示している。しかし、彼らは産卵直後に細菌のコロニー形成が起こる可能性を排除することができず、卵巣マイクロバイオーム16に関するさらなる研究を推奨しました。
当初は Culex pipiens 種複合体の標本用に設計されましたが、このプロトコルは 、ハマダラカ や ネッタイシマカなどの他のベクターを研究する医学昆虫学者のより広範なコミュニティに適用できると予測しています。この手法は、個々の臓器レベルでの運用により、個体内および個体間のゲノム比較が可能となり、共生生物のゲノム変動性を微細なスケールで把握することができ、ベクター制御戦略を前進させる可能性を秘めています。唾液腺、卵巣、および中腸を解剖および分離し、微生物の交差汚染を防ぐこの方法は、これら3つの臓器内のウイルス感染動態研究にも有用なプロトコルになる可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
蚊の唾液腺の解剖方法をジョーダン・ツタガタに教えてくれたギルバート・レゴフと、蚊の臓器の写真を手伝ってくれたジュリアーノ・ムッチに感謝します。私たちは、プロトコールに関する有益な議論をしてくれたAnna-Bella FaeluxとNonito Pagesに感謝します。この作業は、ERC RosaLind Starting Grant “948135” to JR の支援を受けました。Vectopoleプラットフォーム(IRD、モンペリエ)が技術サポートを提供し、蚊の個体群の飼育と維持に役立ててくれたことに感謝します。
Alcohol 96° | Fisher scientific | 10332562 | |
Binocular magnifier | |||
Bleach | RAJA | 145517 | 150 tablets of 1.5 g |
DNA prep kit | Illumina | Provided by MGX sequencing platform | Previously known as Nextera DNA Flex |
DNA-RNA Shield (50 mL) | Zymo research | ZR1100-50 | Preservation buffer |
DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
Filter tips 20 µL | Starlab | S1120-3810 | |
Filter tips 200 µL | Starlab | S1120-8710 | |
Filter tips 1000 µL | Starlab | S1122-1730-C | |
Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11252-20 | Dumont Forceps #5 |
Library quantification kit | Roche | Provided by MGX sequencing platform | KAPA Library Quanitification Kits |
Micropipettes 2-20 µL | Eppendorf | 6.291704 | |
Micropipettes 20-200 µL | Eppendorf | 6.291703 | |
Micropipettes 100-1000 µL | Eppendorf | 7.648488 | |
Microscope slides | Epredia | J1800BMNZ | dimension : 75 mm x 50 mm |
Needles | Terumo | AN*2719R1 | |
NGS kit | Agilent | Provided by MGX sequencing platform | Fragment Analyzer Systems HS Genomic DNA 50kb Kit |
NovaSeq 6000 | Illumina | Provided by MGX sequencing platform | Sequencer |
PBS Phosphate Buffered Saline (Sterile) | Fisher scientific | 10212990 | |
Permanent black marker | |||
Sterile Eppendorf | Dutscher | 33871 | 1.5 mL |
Support for needles | FST (Fine Science Tools) | 26016-12 | Moria MC1 Pin Holder 12 cm |