Les communautés microbiennes chez les moustiques sont très prometteuses pour les stratégies de biocontrôle vectoriel. La plupart des symbiotes sont incultivables et nécessitent des analyses métagénomiques. Nous décrivons une méthode pour disséquer les moustiques femelles et séparer les ovaires, l’intestin moyen et les glandes salivaires, en évitant la contamination croisée, en facilitant les études du microbiome au niveau des organes et en améliorant la compréhension des rôles des micro-organismes dans la biologie des moustiques.
Le fardeau mondial des maladies transmises par les moustiques, notamment le paludisme, la dengue, le Nil occidental, le Zika, l’Usutu et la fièvre jaune, continue d’augmenter, ce qui constitue une menace importante pour la santé publique. Avec l’augmentation de la résistance aux insecticides et l’absence de vaccins efficaces, de nouvelles stratégies émergent qui se concentrent sur le microbiote du moustique. Néanmoins, la majorité des symbiotes restent résistants à la culture. La caractérisation de la diversité et de la fonction des génomes bactériens dans les spécimens de moustiques repose donc sur la métagénomique et les stratégies d’assemblage et de regroupement subséquentes. L’obtention et l’analyse de génomes assemblés par métagénome (MAG) à partir d’organes séparés peuvent notamment fournir des informations clés sur le rôle spécifique des microbes associés aux moustiques dans les ovaires (les organes reproducteurs), l’intestin moyen (clé pour la digestion des aliments et l’immunité) ou les glandes salivaires (essentielles pour la transmission des maladies à transmission vectorielle car les agents pathogènes doivent les coloniser pour pénétrer dans la salive et atteindre la circulation sanguine lors d’un repas sanguin). Ces génomes nouvellement reconstruits peuvent ensuite ouvrir la voie au développement de nouvelles stratégies de biocontrôle vectoriel. Pour ce faire, il est nécessaire d’isoler les organes des moustiques tout en évitant la contamination croisée entre eux ou avec des micro-organismes présents dans d’autres organes de moustiques. Nous décrivons ici un protocole de dissection optimisé et sans contamination pour étudier le microbiome des moustiques au niveau des organes.
Les moustiques propagent un large éventail d’agents pathogènes causant des maladies et constituent une menace sérieuse pour la santé publique. En raison d’une prévalence accrue de la résistance aux insecticides parmi les populations de moustiques et en l’absence de vaccins efficaces contre ces agents pathogènes, de nouvelles méthodes de biocontrôle axées sur le microbiome des moustiques émergent. En particulier, la bactérie intracellulaire Wolbachia, qui peut interférer avec la transmission des agents pathogènes et manipuler la reproduction de l’hôte, se distingue 1,2,3. De plus, d’autres symbiotes de moustiques sont essentiels à la survie, au développement ou au système immunitaire de leur hôte, ainsi qu’à l’infection et à la transmission d’agents pathogènes, et sont très prometteurs pour leur exploitation dans la lutte contre les maladies à transmission vectorielle 4,5,6,7,8.
Les micro-organismes associés aux moustiques couvrent tous les domaines de la vie microbienne (y compris les bactéries, les eucaryotes et les champignons) qui interagissent intimement avec leur hôte mais aussi les uns avec les autres dans les différents compartiments du corps 9,10. Par conséquent, une meilleure compréhension du microbiote, de ses variations saisonnières potentielles11 et des mécanismes par lesquels ses membres interagissent directement dans des tissus distincts de moustiques peut aider à développer de nouvelles méthodes de biocontrôle ciblées ou à améliorer celles existantes. Cependant, la majorité des symbiotes restent résistants à la culture, rendant leur caractérisation impossible.
L’avènement des méthodes de séquençage de deuxième et troisième générations, ainsi que des approches d’assemblage et de binning de pointe, ont permis de reconstruire les génomes microbiens et d’accéder à la diversité et au potentiel fonctionnel des microbes non cultivables. Ici, nous présentons une méthode de dissection des ovaires, de l’intestin moyen et des glandes salivaires des moustiques femelles tout en prévenant la contamination croisée. Ce protocole peut être suivi d’une extraction d’ADN génomique et d’un métacodage à barres ou d’un séquençage métagénomique ultérieur pour explorer la diversité et la fonction du microbiote des moustiques au niveau des organes. Nous fournissons un exemple de dissection de moustiques et de données sur le microbiome pour les spécimens de Culex spp., bien que ce protocole puisse être étendu à des vecteurs d’autres genres tels que Anopheles ou Aedes.
Nous vous recommandons de porter une attention particulière à la séquence de dissection de l’organe, en commençant par les glandes salivaires. En effet, nous avons observé qu’ils étaient plus facilement extraits du thorax des spécimens de Culex si l’intégrité du moustique était préservée. Des dommages à l’abdomen ou au thorax pourraient réduire la pression dans le corps du moustique, entravant la procédure. Cependant, il est également possible de couper entre le thorax et l’abdomen puis d’extraire les glandes salivaires de la tête et du thorax (A. B. Failloux, communication personnelle). De plus, il peut être difficile d’acquérir des compétences de dissection, c’est pourquoi nous vous suggérons de vous entraîner sur un nombre adéquat d’échantillons avant l’expérience.
Isoler les organes des moustiques tout en évitant la contamination croisée de manière systématique est crucial pour un large éventail d’analyses du microbiote des moustiques en aval. Une étude métagénomique résolue par le génome suite à la dissection d’ovaires uniques de spécimens de Culex pipiens dans le sud de la France a permis de découvrir le premier plasmide de Wolbachia chez Culex pipiens (pWCP14). En utilisant une approche similaire, nous avons étudié la distribution et la fréquence de la pWCP chez les spécimens de Culex pipiens et de Culex quinquefasciatus provenant de zones continentales et insulaires du monde entier, dans diverses conditions environnementales et de laboratoire. Dans l’ensemble, les données ont révélé un élément plasmidique Wolbachia remarquablement conservé chez les moustiques Culex , suggérant un rôle crucial pour cet élément mobile dans la biologie des endosymbiotes15, justifiant une analyse plus approfondie.
Nous fournissons ici d’autres exemples d’analyses du microbiome des moustiques sur des échantillons d’intestin moyen et d’ovaire obtenus à l’aide de cette procédure systématique. Nous avons observé une nette différence de microbiote entre les tissus (Figure 5), avec des taxons bactériens communs et spécifiques à un organe. Comme prévu, la présence de Wolbachia a été détectée dans les deux organes, avec une abondance relative plus élevée (basée sur de courtes lectures non assemblées) et une couverture moyenne des MAG dans les ovaires des moustiques par rapport aux intestins moyens, ce qui correspond à l’observation selon laquelle cet endosymbiote est transmis par les ovaires et se propage ensuite aux tissus somatiques. Bien que cette étude ait été limitée à des échantillons de Nouvelle-Calédonie, ce protocole pourrait faciliter l’étude de la variabilité génomique de Wolbachia à l’échelle mondiale, ainsi que de son rôle dans divers phénotypes, y compris la régulation de la densité et la protection virale. De plus, ce travail illustre comment la procédure de dissection présentée ici permet d’examiner la diversité taxonomique et les capacités fonctionnelles potentielles des symbiotes de moustiques dans des échantillons d’intestin moyen.
Nous avons obtenu deux ébauches de génomes entérobactériens qui n’étaient présentes que dans deux échantillons d’intestin moyen, confirmant l’absence de contamination entre les organes pour ces deux échantillons. En ce qui concerne les spirochètes, détectés à la fois dans l’intestin moyen et les ovaires de l’individu 3, Juma et ses collègues ont observé en 2020 la présence de ces bactéries à la surface des radeaux d’œufs. Les auteurs ont suggéré que les communautés bactériennes trouvées dans les radeaux d’œufs pourraient être principalement héritées de la mère des ovaires, étant donné que les radeaux d’œufs étaient conservés dans de l’eau désionisée et exempte de bactéries. Cependant, ils n’ont pas pu exclure la possibilité d’une colonisation bactérienne juste après la ponte et ont recommandé une étude plus approfondie sur le microbiome ovaire16.
Bien qu’initialement conçu pour des spécimens du complexe d’espèces Culex pipiens , nous prévoyons l’applicabilité de ce protocole à une communauté plus large d’entomologistes médicaux étudiant d’autres vecteurs tels que les anophèles ou les aedes. En opérant au niveau des organes individuels, cette méthode peut permettre des comparaisons génomiques intra et interindividuelles, offrant des informations sur la variabilité génomique des symbiotes à une petite échelle, avec le potentiel de faire progresser les stratégies de lutte antivectorielle. Cette méthode de dissection et d’isolement des glandes salivaires, des ovaires et de l’intestin moyen, prévenant la contamination croisée microbienne, pourrait également être un protocole utile pour les études de dynamique des infections virales au sein de ces trois organes.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Gilbert Legoff d’avoir enseigné à Jordan Tutagata comment disséquer les glandes salivaires des moustiques et Giuliano Mucci de nous avoir aidés avec des photos des organes des moustiques. Nous remercions Anna-Bella Failloux et Nonito Pages pour la discussion utile sur le protocole. Ce travail a été soutenu par la bourse de démarrage ERC RosaLind « 948135 » à JR. Nous remercions la plateforme Vectopole (IRD, Montpellier) pour l’appui technique et pour l’élevage et le maintien des populations de moustiques.
Alcohol 96° | Fisher scientific | 10332562 | |
Binocular magnifier | |||
Bleach | RAJA | 145517 | 150 tablets of 1.5 g |
DNA prep kit | Illumina | Provided by MGX sequencing platform | Previously known as Nextera DNA Flex |
DNA-RNA Shield (50 mL) | Zymo research | ZR1100-50 | Preservation buffer |
DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
Filter tips 20 µL | Starlab | S1120-3810 | |
Filter tips 200 µL | Starlab | S1120-8710 | |
Filter tips 1000 µL | Starlab | S1122-1730-C | |
Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11252-20 | Dumont Forceps #5 |
Library quantification kit | Roche | Provided by MGX sequencing platform | KAPA Library Quanitification Kits |
Micropipettes 2-20 µL | Eppendorf | 6.291704 | |
Micropipettes 20-200 µL | Eppendorf | 6.291703 | |
Micropipettes 100-1000 µL | Eppendorf | 7.648488 | |
Microscope slides | Epredia | J1800BMNZ | dimension : 75 mm x 50 mm |
Needles | Terumo | AN*2719R1 | |
NGS kit | Agilent | Provided by MGX sequencing platform | Fragment Analyzer Systems HS Genomic DNA 50kb Kit |
NovaSeq 6000 | Illumina | Provided by MGX sequencing platform | Sequencer |
PBS Phosphate Buffered Saline (Sterile) | Fisher scientific | 10212990 | |
Permanent black marker | |||
Sterile Eppendorf | Dutscher | 33871 | 1.5 mL |
Support for needles | FST (Fine Science Tools) | 26016-12 | Moria MC1 Pin Holder 12 cm |