Las comunidades microbianas de los mosquitos son muy prometedoras para las estrategias de biocontrol de vectores. La mayoría de los simbiontes son incultivables, lo que requiere análisis metagenómicos. Describimos un método para diseccionar mosquitos hembra y separar los ovarios, el intestino medio y las glándulas salivales evitando la contaminación cruzada, facilitando los estudios del microbioma a nivel de órgano y mejorando la comprensión de las funciones de los microorganismos en la biología de los mosquitos.
La carga mundial de enfermedades transmitidas por mosquitos, como el paludismo, el dengue, el virus del Nilo Occidental, el zika, el usutu y la fiebre amarilla, sigue aumentando, lo que supone una importante amenaza para la salud pública. Con el aumento de la resistencia a los insecticidas y la ausencia de vacunas eficaces, están surgiendo nuevas estrategias centradas en la microbiota del mosquito. Sin embargo, la mayoría de los simbiontes siguen siendo resistentes al cultivo. Por lo tanto, la caracterización de la diversidad y la función de los genomas bacterianos en especímenes de mosquitos se basa en la metenómica y en las estrategias posteriores de ensamblaje y agrupación. La obtención y el análisis de genomas ensamblados por metagenomas (MAG) a partir de órganos separados puede proporcionar información clave sobre el papel específico de los microbios asociados a los mosquitos en los ovarios (los órganos reproductivos), el intestino medio (clave para la digestión de los alimentos y la inmunidad) o las glándulas salivales (esenciales para la transmisión de enfermedades transmitidas por vectores, ya que los patógenos deben colonizarlas para entrar en la saliva y llegar al torrente sanguíneo durante una ingesta de sangre). Estos genomas recién reconstruidos pueden allanar el camino para el desarrollo de nuevas estrategias de biocontrol de vectores. Para ello, es necesario aislar los órganos de los mosquitos evitando la contaminación cruzada entre ellos o con microorganismos presentes en otros órganos de los mosquitos. Aquí, describimos un protocolo de disección optimizado y libre de contaminación para estudiar el microbioma de mosquitos a nivel de órganos.
Los mosquitos propagan una amplia gama de patógenos que causan enfermedades y son una grave amenaza para la salud pública. Debido a una mayor prevalencia de resistencia a los insecticidas entre las poblaciones de mosquitos y en ausencia de vacunas efectivas contra estos patógenos, están surgiendo nuevos métodos de control biológico que se centran en el microbioma del mosquito. En particular, se destaca la bacteria intracelular Wolbachia, que puede interferir con la transmisión de patógenos y manipular la reproducción del huésped 1,2,3. Además, otros mosquitos simbiontes son fundamentales para la supervivencia, el desarrollo o el sistema inmunitario de su huésped, así como para la infección y la transmisión de patógenos, y son muy prometedores para su explotación en la lucha contra las enfermedades transmitidas por vectores 4,5,6,7,8.
Los microorganismos asociados a los mosquitos abarcan todos los dominios de la vida microbiana (incluyendo bacterias, eucariotas y hongos) que interactúan íntimamente con su huésped pero también entre sí en los diferentes compartimentos del cuerpo 9,10. Por lo tanto, una mejor comprensión de la microbiota, de su potencial variación estacional11 y de los mecanismos por los que sus miembros interactúan directamente en los distintos tejidos de los mosquitos puede ayudar a desarrollar nuevos métodos de biocontrol específicos o mejorar los existentes. Sin embargo, la mayoría de los simbiontes siguen siendo resistentes al cultivo, lo que hace imposible su caracterización.
El advenimiento de los métodos de secuenciación de segunda y tercera generación, junto con los enfoques de ensamblaje y agrupamiento de última generación, han permitido la reconstrucción de los genomas microbianos y el acceso a la diversidad y el potencial funcional de los microbios no cultivables. Aquí, presentamos un método para la disección de los ovarios, el intestino medio y las glándulas salivales de mosquitos hembra mientras se previene la contaminación cruzada. Este protocolo puede ser seguido por la extracción genómica de ADN y la posterior metabarcoding o secuenciación metagenómica de escopeta para explorar la diversidad y la función de la microbiota de mosquitos a nivel de órganos. Proporcionamos un ejemplo de disección de mosquitos y datos de microbioma para especímenes de Culex spp., aunque este protocolo puede extenderse a vectores de otros géneros como Anopheles o Aedes.
Recomendamos prestar especial atención a la secuencia de disección de los órganos, empezando por las glándulas salivales. De hecho, observamos que se extraían más fácilmente del tórax de los especímenes de Culex si se preservaba la integridad del mosquito. El daño en el abdomen o el tórax podría reducir la presión en el cuerpo del mosquito, lo que dificultaría el procedimiento. Sin embargo, también es posible cortar entre el tórax y el abdomen y luego extraer las glándulas salivales de la cabeza y el tórax (A. B. Failloux, comunicación personal). Además, adquirir habilidades de disección competentes puede ser un desafío, por lo que sugerimos practicar con un número adecuado de especímenes antes del experimento.
Aislar los órganos de los mosquitos y evitar la contaminación cruzada de manera sistemática es crucial para una amplia gama de análisis posteriores de la microbiota de los mosquitos. Un estudio metagenómico resuelto genómicamente tras la disección de ovarios individuales de especímenes de Culex pipiens en el sur de Francia permitió descubrir el primer plásmido de Wolbachia es Culex pipiens (pWCP14). Utilizando un enfoque similar, investigamos la distribución y frecuencia de pWCP en especímenes de Culex pipiens y Culex quinquefasciatus de áreas continentales e insulares de todo el mundo, en diversas condiciones ambientales y de laboratorio. En general, los datos revelaron un elemento plásmido Wolbachia notablemente conservado en los mosquitos Culex , lo que sugiere un papel crucial de este elemento móvil en la biología endosimbionte15, lo que justifica un análisis más detallado.
A continuación, proporcionamos ejemplos adicionales de análisis de microbioma de mosquitos en muestras de intestino medio y ovario obtenidas mediante este procedimiento sistemático. Observamos una clara diferencia en la microbiota entre los tejidos (Figura 5), con taxones bacterianos compartidos y específicos de órganos. Como era de esperar, se detectó la presencia de Wolbachia en ambos órganos, con mayor abundancia relativa (basada en lecturas cortas no ensambladas) y cobertura media de MAG en los ovarios de los mosquitos en comparación con los intestinos medios, lo que concuerda con la observación de que este endosimbionte se transmite a través de los ovarios y posteriormente se propaga a los tejidos somáticos. Aunque este estudio se limitó a muestras de Nueva Caledonia, este protocolo puede facilitar la investigación de la variabilidad genómica de Wolbachia a escala mundial, así como su papel en varios fenotipos, incluida la regulación de la densidad de sí misma y la protección viral. Además, este trabajo ejemplifica cómo el procedimiento de disección presentado aquí permite examinar la diversidad taxonómica y las capacidades funcionales potenciales de los simbiontes mosquitos dentro de muestras del intestino medio.
Obtuvimos dos genomas preliminares de enterobacterias que solo estaban presentes en dos muestras del intestino medio, lo que confirma la falta de contaminación entre órganos para estos dos especímenes. En cuanto a las espiroquetas, detectadas tanto en el intestino medio como en los ovarios del individuo 3, Juma y colaboradores, en 2020 observaron la presencia de estas bacterias en la superficie de las balsas de huevos. Los autores sugirieron que las comunidades bacterianas encontradas en las balsas de huevos podrían ser principalmente heredadas por la madre de los ovarios, dado que las balsas de huevos se mantuvieron en agua desionizada y libre de bacterias. Sin embargo, no pudieron descartar la posibilidad de que la colonización bacteriana ocurriera justo después de la oviposición y recomendaron más estudios sobre el microbioma ovárico16.
Aunque inicialmente se diseñó para especímenes del complejo de especies Culex pipiens , prevemos la aplicabilidad de este protocolo a una comunidad más amplia de entomólogos médicos que estudian otros vectores como Anopheles o Aedes. Al operar a nivel de órganos individuales, este método puede permitir comparaciones genómicas tanto intra como interindividuales, ofreciendo información sobre la variabilidad genómica de los simbiontes a una escala fina, con el potencial de avanzar en las estrategias de control de vectores. Este método de disección y aislamiento de las glándulas salivales, los ovarios y el intestino medio, evitando la contaminación cruzada microbiana, también podría ser un protocolo útil para los estudios de dinámica de infecciones virales dentro de estos tres órganos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Gilbert Legoff por enseñarle a Jordan Tutagata cómo diseccionar las glándulas salivales de los mosquitos y a Giuliano Mucci por ayudar con las fotos de los órganos de los mosquitos. Agradecemos a Anna-Bella Failloux y Nonito Pages por su útil discusión sobre el protocolo. Este trabajo contó con el apoyo de la subvención inicial RosaLind del ERC “948135” a JR. Agradecemos a la plataforma Vectopole (IRD, Montpellier) por brindar apoyo técnico y por la cría y mantenimiento de las poblaciones de mosquitos.
Alcohol 96° | Fisher scientific | 10332562 | |
Binocular magnifier | |||
Bleach | RAJA | 145517 | 150 tablets of 1.5 g |
DNA prep kit | Illumina | Provided by MGX sequencing platform | Previously known as Nextera DNA Flex |
DNA-RNA Shield (50 mL) | Zymo research | ZR1100-50 | Preservation buffer |
DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
Filter tips 20 µL | Starlab | S1120-3810 | |
Filter tips 200 µL | Starlab | S1120-8710 | |
Filter tips 1000 µL | Starlab | S1122-1730-C | |
Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11252-20 | Dumont Forceps #5 |
Library quantification kit | Roche | Provided by MGX sequencing platform | KAPA Library Quanitification Kits |
Micropipettes 2-20 µL | Eppendorf | 6.291704 | |
Micropipettes 20-200 µL | Eppendorf | 6.291703 | |
Micropipettes 100-1000 µL | Eppendorf | 7.648488 | |
Microscope slides | Epredia | J1800BMNZ | dimension : 75 mm x 50 mm |
Needles | Terumo | AN*2719R1 | |
NGS kit | Agilent | Provided by MGX sequencing platform | Fragment Analyzer Systems HS Genomic DNA 50kb Kit |
NovaSeq 6000 | Illumina | Provided by MGX sequencing platform | Sequencer |
PBS Phosphate Buffered Saline (Sterile) | Fisher scientific | 10212990 | |
Permanent black marker | |||
Sterile Eppendorf | Dutscher | 33871 | 1.5 mL |
Support for needles | FST (Fine Science Tools) | 26016-12 | Moria MC1 Pin Holder 12 cm |