Mikrobielle Gemeinschaften in Mücken sind vielversprechend für biologische Vektorkontrollstrategien. Die meisten Symbionten sind nicht kultivierbar und erfordern metagenomische Analysen. Wir beschreiben eine Methode zur Sezierung weiblicher Mücken und zur Trennung von Eierstöcken, Mitteldarm- und Speicheldrüsen, um Kreuzkontaminationen zu verhindern, Mikrobiomstudien auf Organebene zu erleichtern und das Verständnis der Rolle von Mikroorganismen in der Mückenbiologie zu verbessern.
Die weltweite Belastung durch durch Stechmücken übertragene Krankheiten wie Malaria, Dengue-Fieber, West-Nil-Fieber, Zika, Usutu und Gelbfieber nimmt weiter zu und stellt eine erhebliche Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Mit der Zunahme von Insektizidresistenzen und dem Fehlen wirksamer Impfstoffe entstehen neue Strategien, die sich auf die Mikrobiota der Mücke konzentrieren. Dennoch bleibt der Großteil der Symbionten resistent gegen die Kultivierung. Die Charakterisierung der Diversität und Funktion bakterieller Genome in Mückenproben beruht daher auf Metagenomik und anschließenden Assemblierungs- und Binning-Strategien. Die Erfassung und Analyse von Metagenom-assemblierten Genomen (MAGs) aus getrennten Organen kann insbesondere wichtige Informationen über die spezifische Rolle von Mücken-assoziierten Mikroben in den Eierstöcken (den Fortpflanzungsorganen), dem Mitteldarm (Schlüssel für die Nahrungsverdauung und Immunität) oder den Speicheldrüsen (essentiell für die Übertragung von vektorübertragenen Krankheiten, da Krankheitserreger sie besiedeln müssen, um in den Speichel zu gelangen und den Blutkreislauf während einer Blutmahlzeit zu erreichen) liefern. Diese neu rekonstruierten Genome können dann den Weg für die Entwicklung neuartiger Vektor-Biokontrollstrategien ebnen. Zu diesem Zweck ist es erforderlich, Mückenorgane zu isolieren und gleichzeitig eine Kreuzkontamination zwischen ihnen oder mit Mikroorganismen in anderen Mückenorganen zu vermeiden. Hier beschreiben wir ein optimiertes und kontaminationsfreies Dissektionsprotokoll zur Untersuchung des Mückenmikrobioms auf Organebene.
Stechmücken verbreiten eine Vielzahl von Krankheitserregern und stellen eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Aufgrund einer erhöhten Prävalenz von Insektizidresistenzen in Mückenpopulationen und in Ermangelung wirksamer Impfstoffe gegen diese Krankheitserreger entstehen neue biologische Bekämpfungsmethoden, die sich auf das Mückenmikrobiom konzentrieren. Insbesondere sticht das intrazelluläre Bakterium Wolbachia hervor, das die Übertragung von Krankheitserregern stören und die Wirtsvermehrung manipulieren kann 1,2,3. Darüber hinaus sind andere Mückensymbionten von zentraler Bedeutung für das Überleben, die Entwicklung oder das Immunsystem ihres Wirts sowie für die Infektion und Übertragung von Krankheitserregern und vielversprechend für ihre Nutzung zur Bekämpfung vektorübertragener Krankheiten 4,5,6,7,8.
Mikroorganismen, die mit Mücken assoziiert sind, erstrecken sich über alle Bereiche des mikrobiellen Lebens (einschließlich Bakterien, Eukaryoten und Pilze), die eng mit ihrem Wirt, aber auch miteinander in den verschiedenen Körperkompartimenten interagieren 9,10. Daher kann ein besseres Verständnis der Mikrobiota, ihrer potenziellen saisonalen Variation11 und der Mechanismen, durch die ihre Mitglieder direkt in verschiedenen Mückengeweben interagieren, dazu beitragen, neue gezielte biologische Bekämpfungsmethoden zu entwickeln oder bestehende zu verbessern. Die Mehrzahl der Symbionten bleibt jedoch resistent gegen die Kultivierung, so dass ihre Charakterisierung unmöglich ist.
Das Aufkommen von Sequenzierungsmethoden der zweiten und dritten Generation in Verbindung mit modernsten Assemblierungs- und Binning-Ansätzen hat die Rekonstruktion mikrobieller Genome und den Zugang zur Vielfalt und zum funktionellen Potenzial nicht kultivierbarer Mikroben ermöglicht. Hier stellen wir eine Methode vor, mit der die Eierstöcke, der Mitteldarm und die Speicheldrüsen weiblicher Mücken dissektioniert und gleichzeitig eine Kreuzkontamination verhindert werden kann. Diesem Protokoll kann eine genomische DNA-Extraktion und eine anschließende Metabarcodierung oder metagenomische Sequenzierung folgen, um die Vielfalt und Funktion der Mückenmikrobiota auf Organebene zu untersuchen. Wir stellen ein Beispiel für die Stechmückendissektion und Mikrobiomdaten für Culex spp.-Proben zur Verfügung, obwohl dieses Protokoll auf Vektoren anderer Gattungen wie Anopheles oder Aedes ausgeweitet werden kann.
Wir empfehlen, besonders auf die Abfolge der Organdissektion zu achten, beginnend mit den Speicheldrüsen. Tatsächlich beobachteten wir, dass sie leichter aus dem Thorax von Culex-Exemplaren extrahiert werden konnten, wenn die Integrität der Mücke erhalten blieb. Eine Schädigung des Bauches oder des Brustkorbs kann den Druck im Körper der Mücke verringern und den Eingriff erschweren. Es ist aber auch möglich, zwischen Thorax und Bauch zu schneiden und dann die Speicheldrüsen aus Kopf und Thorax herauszuziehen (A. B. Failloux, persönliche Mitteilung). Darüber hinaus kann es eine Herausforderung sein, kompetente Präparierfähigkeiten zu erwerben, daher empfehlen wir, vor dem Experiment an einer ausreichenden Anzahl von Proben zu üben.
Die Isolierung von Mückenorganen bei gleichzeitiger systematischer Vermeidung von Kreuzkontaminationen ist entscheidend für eine Vielzahl von nachgelagerten Mikrobiota-Analysen von Mücken. Eine genomaufgelöste metagenomische Studie nach der Dissektion einzelner Eierstöcke aus Culex pipiens-Proben in Südfrankreich ermöglichte die Entdeckung des ersten Plasmids von Wolbachia in Culex pipiens (pWCP14). Mit einem ähnlichen Ansatz untersuchten wir die Verteilung und Häufigkeit von pWCP in Culex pipiens– und Culex quinquefasciatus-Proben sowohl aus kontinentalen als auch aus Inselgebieten weltweit, unter verschiedenen Umwelt- und Laborbedingungen. Insgesamt zeigten die Daten ein bemerkenswert konserviertes Wolbachia-Plasmidelement in Culex-Mücken, was auf eine entscheidende Rolle dieses mobilen Elements in der Endosymbiontenbiologie hindeutet15, was eine weitere Analyse rechtfertigt.
Hier stellen wir weitere Beispiele für Mücken-Mikrobiom-Analysen an Mitteldarm- und Eierstockproben vor, die mit diesem systematischen Verfahren gewonnen wurden. Wir beobachteten einen deutlichen Unterschied in der Mikrobiota zwischen den Geweben (Abbildung 5), wobei sowohl gemeinsame als auch organspezifische bakterielle Taxa vorhanden waren. Wie erwartet wurde das Vorhandensein von Wolbachia in beiden Organen nachgewiesen, mit einer höheren relativen Abundanz (basierend auf unassemblierten Short Reads) und einer mittleren Abdeckung von MAGs in den Mücken-Ovarien im Vergleich zu den Mitteldärmen, was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass dieser Endosymbiont über die Eierstöcke übertragen wird und sich anschließend auf das somatische Gewebe ausbreitet. Obwohl diese Studie auf Proben aus Neukaledonien beschränkt war, kann dieses Protokoll die Untersuchung der genomischen Variabilität von Wolbachia auf globaler Ebene sowie seiner Rolle bei verschiedenen Phänotypen, einschließlich der Dichteregulation von sich selbst und des Virusschutzes, erleichtern. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit beispielhaft, wie das hier vorgestellte Präparierungsverfahren die Untersuchung der taxonomischen Diversität und der potentiellen funktionellen Fähigkeiten von Mückensymbionten in Mitteldarmproben ermöglicht.
Wir erhielten zwei enterobakterielle Entwurfsgenome, die nur in zwei Mitteldarmproben vorhanden waren, was die fehlende Kontamination zwischen den Organen für diese beiden Proben bestätigt. In Bezug auf Spirochäten, die sowohl im Mitteldarm als auch in den Eierstöcken von Individuum nachgewiesen wurden 3, beobachteten Juma und Kollegen im Jahr 2020 das Vorhandensein dieser Bakterien auf der Oberfläche von Eierflößen. Die Autoren schlugen vor, dass die Bakteriengemeinschaften, die in den Eierflößen gefunden wurden, in erster Linie mütterlich von den Eierstöcken vererbt werden könnten, da die Eierflöße in entionisiertem und bakterienfreiem Wasser gehalten wurden. Sie konnten jedoch nicht ausschließen, dass es direkt nach der Eiablage zu einer bakteriellen Besiedlung kommt und empfahlen weitere Untersuchungen des Mikrobioms der Eierstöcke16.
Obwohl dieses Protokoll ursprünglich für Exemplare des Culex pipiens-Artenkomplexes entwickelt wurde, sehen wir die Anwendbarkeit dieses Protokolls auf eine breitere Gemeinschaft von medizinischen Entomologen, die andere Vektoren wie Anopheles oder Aedes untersuchen. Durch die Arbeit auf der Ebene einzelner Organe kann diese Methode sowohl intra- als auch interindividuelle genomische Vergleiche ermöglichen und Einblicke in die genomische Variabilität von Symbionten auf einer feinen Skala bieten, mit dem Potenzial, Vektorkontrollstrategien voranzutreiben. Diese Methode der Dissektion und Isolierung der Speicheldrüsen, Eierstöcke und des Mitteldarms, die eine mikrobielle Kreuzkontamination verhindert, könnte auch ein nützliches Protokoll für Studien zur Dynamik von Virusinfektionen in diesen drei Organen sein.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Gilbert Legoff dafür, dass er Jordan Tutagata beigebracht hat, wie man Speicheldrüsen von Mücken präpariert, und Giuliano Mucci für seine Hilfe mit Fotos der Mückenorgane. Wir danken Anna-Bella Failloux und Nonito Pages für die hilfreiche Diskussion über das Protokoll. Diese Arbeit wurde durch den ERC RosaLind Starting Grant “948135” für JR unterstützt. Wir danken der Vectopole-Plattform (IRD, Montpellier) für die technische Unterstützung sowie für die Aufzucht und Pflege der Mückenpopulationen.
Alcohol 96° | Fisher scientific | 10332562 | |
Binocular magnifier | |||
Bleach | RAJA | 145517 | 150 tablets of 1.5 g |
DNA prep kit | Illumina | Provided by MGX sequencing platform | Previously known as Nextera DNA Flex |
DNA-RNA Shield (50 mL) | Zymo research | ZR1100-50 | Preservation buffer |
DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
Filter tips 20 µL | Starlab | S1120-3810 | |
Filter tips 200 µL | Starlab | S1120-8710 | |
Filter tips 1000 µL | Starlab | S1122-1730-C | |
Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11252-20 | Dumont Forceps #5 |
Library quantification kit | Roche | Provided by MGX sequencing platform | KAPA Library Quanitification Kits |
Micropipettes 2-20 µL | Eppendorf | 6.291704 | |
Micropipettes 20-200 µL | Eppendorf | 6.291703 | |
Micropipettes 100-1000 µL | Eppendorf | 7.648488 | |
Microscope slides | Epredia | J1800BMNZ | dimension : 75 mm x 50 mm |
Needles | Terumo | AN*2719R1 | |
NGS kit | Agilent | Provided by MGX sequencing platform | Fragment Analyzer Systems HS Genomic DNA 50kb Kit |
NovaSeq 6000 | Illumina | Provided by MGX sequencing platform | Sequencer |
PBS Phosphate Buffered Saline (Sterile) | Fisher scientific | 10212990 | |
Permanent black marker | |||
Sterile Eppendorf | Dutscher | 33871 | 1.5 mL |
Support for needles | FST (Fine Science Tools) | 26016-12 | Moria MC1 Pin Holder 12 cm |