概要

レチニリデンタンパク質の生成におけるビタミンA膜受容体およびオプシンタンパク質とそれらのリガンドとの相互作用を研究するための方法論

Published: October 04, 2024
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概要

ここでは、ビタミンA膜受容体および光受容体オプシンとそれぞれの生理的リガンドとのタンパク質-リガンド相互作用を研究するための2つの定量的手法について説明します。

Abstract

食事性ビタミンA/オールトランス レチノール(ROL)の全身への分布は、末梢組織のレチノイド機能を維持し、視覚機能のためのレチニリデンタンパク質を生成するために重要です。RBP4-ROLは、ROLと血液中に存在するレチノール結合タンパク質4(RBP4)との複合体です。肝臓のレチノール結合タンパク質4受容体2(RBPR2)と眼のレチノイン酸6レチノール(STRA6)による受容体の2つの膜受容体は、循環器系RBP4に結合し、このメカニズムはROLを細胞に取り込むために重要です。レチノイド恒常性に対するビタミンA受容体の生理学的機能を理解するためには、受容体-リガンド動態を調べる方法を確立することが不可欠です。Surface Plasmon Resonance(SPR)アッセイを用いて、ビタミンA膜受容体とその生理的リガンドRBP4との結合親和性および速度論的パラメータを解析することができます。

これらの方法論は、ビタミンA欠乏症の病態を理解するために重要なRBPR2およびSTRA6のRBP4結合モチーフの新しい構造的および生化学的情報を明らかにすることができます。眼では、内在化されたROLは、光受容体のオプシンに結合してレチニリデンタンパク質であるロドプシンを形成する視覚発色団である11-シスレチナールに代謝されます。光の吸光度は、11-シスレチナールのシスからトランスへの異性化を引き起こし、ロドプシンの立体配座変化とそれに続く光伝達カスケードの活性化を誘導します。血清および眼のROLの濃度の低下は、レチニリデンタンパク質の形成に影響を与える可能性があり、その結果、ロドプシンの誤局在化、アポタンパク質オプシンの蓄積、夜盲症、および視細胞の外側セグメントの変性を引き起こし、網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障につながる可能性があります。

したがって、網膜内のGタンパク質共役受容体オプシン-11-シス 網膜複合体を定量するための分光光度法は、上記の病理学的状態における網膜細胞変性のメカニズムを理解するために重要です。これらの包括的な方法論により、研究者は、ヒトの視覚機能を維持するために重要な光受容体のレチニリデンタンパク質濃度の生成と維持に重要な全身および眼のレチノイド恒常性を維持するための食事性ビタミンA供給をより適切に評価できるようになります。

Introduction

食事から得られるビタミンA/オールトランスレチノール/ROLは、視覚機能に重要な役割を果たす成分です1,2食性ビタミンAの代謝産物である発色団11-シスレチナールは、Gタンパク質共役受容体(GPCR)オプシンに結合して、光受容体でレチニリデンタンパク質であるロドプシンを生成します。光が眼に当たると、ロドプシンの構成は、その11-シス-レチナール成分がオールトランス-レチナールに変換されることで根本的な変化を遂げます。この配置変化は、桿体視細胞内で光伝達カスケードを引き起こし、光を電気信号に変換し、視神経3,4,5,6,7,8,9,10を介して脳内の視覚野に伝達される.血清および眼のROLの濃度の低下は、レチニリデンタンパク質の形成に影響を与える可能性があり、それが次にオプシンの誤局在、アポタンパク質オプシンの蓄積、夜盲症、および光受容体OS変性を引き起こし、網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障を引き起こし、失明を引き起こす可能性があります3,10

オールトランスレチノールは、食事性ビタミンAの基本的な輸送形態であり、すべての機能性レチノイドと食事性ビタミンA代謝産物が由来する源です。肝臓は、食事中のビタミンAを貯蔵するための主要な器官として機能します。肝臓のレチノールは、レチノール結合タンパク質4(RBP4)との複合体として血清を介して輸送されます。RBP4は、主に肝臓で発現し、レチノール基質およびトランスサイレチン(TTR)とホロ複合体を形成し、トランスサイレチン(TTR)は循環に入ります11,12,13,14,15,16,17。1970年代にRBP4の細胞表面受容体が報告されたことで、膜輸送タンパク質がレチノイドの細胞内外への輸送を助けるという仮説が立てられました。RBP4結合レチノール(RBP4-ROL)の細胞表面受容体は、眼の網膜色素上皮(RPE)においてレチノイン酸6レチノール(STRA6)によってSTimulatedと同定されました。STRA6は、循環中のホロ-RBP4複合体に結合し、RBP4結合レチノールをRPEを横切ってシャトルして、光受容体18,19によって利用される。STRA6の変異は、眼のROL濃度の低下に関連する無数の疾患や表現型につながる可能性があります。発生中のSTRA6変異は、無眼球症、小眼球症、およびマシュー・ウッド症候群20,21,22,23,24,25,26,27に関連する表現型と重複するその他の非眼症状を引き起こす可能性があります。STRA6は、眼のRPEなど、さまざまな臓器や組織で発現しますが、すべての組織で発現するわけではありません26,27。レチノイドの貯蔵の主要な部位は肝臓ですが、STRA6は肝臓では発現しません。

Alapattたちは、レチノール結合タンパク質4受容体2(RBPR2)がRBP4に高い親和性で結合し、RPE28のSTRA6と同様に、肝臓でのRBP4結合レチノールの取り込みに関与していることを発見しました。RBPR2は、STRA6と構造的相同性を共有することが報告されています29,30,31。RBP4は、RBPR2とSTRA6の間で部分的に保存されたアミノ酸結合ドメインであるRBPR2上の残基S294、Y295、およびL296に結合することが提案されている29,30,31。これらの研究から、1つ以上の細胞外結合残基/ドメインを含むSTRA6やRBPR2などのビタミンA膜受容体は、循環RBP4-ROLと相互作用することが提案されています。したがって、膜受容体は、肝臓や眼などの標的組織へのROLの内在化のために、循環RBP4への受容体結合に重要な役割を果たします。

この研究の最初の部分では、表面プラズモン共鳴(SPR)を利用して、2つのビタミンA膜受容体(RBPR2およびSTRA6)とそれらの生理的リガンドRBP4との相互作用を調査しました31。タンパク質のリガンド複合体への結合親和性および会合/解離速度は、SPRを用いてリアルタイムで測定することができる。この方法論は、ビタミンA欠乏症の病理学的状態を理解するために重要なRBPR2およびSTRA6のRBP4結合モチーフに関する重要な速度論的、構造的、および生化学的情報を提供することを目的としていました31,32。上述したように、循環ROLは、STRA6を介してRPEに内在化され、発色団11-cisレチナールを生成し、この発色団はオプシンに結合して光受容体33においてレチニリデンタンパク質であるロドプシンを生成する。我々は、眼鏡光度法を用いて、網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障眼の病理状態におけるレチニリデンタンパク質、ロドプシンの減少メカニズムを理解するために重要なマウス網膜溶解物中のGPCR-オプシンとそのリガンド11-cis網膜複合体を定量化した34。一般に、これらのプロトコルは、全身および眼のビタミンA恒常性に影響を与える変異型RBP4STRA6、またはRBPR2の生理学的影響、または変異型ロドプシンまたはレチノイドサイクルタンパク質が視覚機能に与える影響をin vitroで研究するために適用できます35,36

Protocol

1. 表面プラズモン共鳴(SPR)法 マウスRBP4タンパク質の調製と精製完全長マウスRBP4 (msRBP4) cDNA (NCBI Reference Sequence: NM_001159487.1) を作製するためのプライマーを設計します。 msRBP4 cDNAをpET28a Hisタグカナマイシン耐性発現ベクターにクローニングし、BL-21 DE3細胞で発現させます(材料表)。 BL-21 DE3コンピテントセル(?…

Representative Results

ビタミンA膜受容体および光受容体オプシンとそれぞれの生理学的リガンドとのタンパク質-リガンド相互作用を研究するための定量的方法が説明されています。組換えマウスRBP4は、大腸菌で発現し、精製されたタンパク質はSPRチップ上の標識リガンドとして使用する必要があります。~40アミノ酸ペプチドの化学合成されたRBPR2、STRA6、および変異体S294A RBPR2「SYL…

Discussion

プロトコルの重要なステップ
SPRの方法論
インシリコモデリングとドッキング解析:RBPR2(https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1)とSTRA6の予測構造、およびmsRBP4 PDBデータベースの既知の構造(RSCB PDB ID:2wqa)は、ドッキングスタディ29,31に使用する必要があります。さらに、ビタミンA受容体(RBPR2?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、ロドプシン吸光度プロトコルに関するアドバイスをいただいたBeata Jastrzebska博士(オハイオ州ケースウェスタンリザーブ大学薬理学部)に感謝します。この研究は、NIH-NEIの助成金(EY030889および3R01EY030889-03S1)と、一部はミネソタ大学のG.P.L.へのスタートアップファンドによって支援されました。

Materials

2-D Quant Kit Cytiva 80648356
Amine Coupling Kit Cytiva BR100050
Biacore evaluation software Biacore S200 Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5 Cytiva BR100530
Bis tris propane Sigma B6755-25G 20 mM
BL21 DE3 competent cells Thermo Scientific EC0114
CD spectrophotometer Jasco J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL Fisher Bioreagents BP381-1
GraphPad Prism  Model fitting, data analysis
LB broth Fisher Bioreagents BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM) EMD Millipore 324355-1GM 2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector  Addgene 69864-3
Plasmid purification kit Qiagen 27106
Rho1D4 MagBeads CubeBiotech 33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette Thermo Scientific 66810
Tween20 Fisher Bioreagents BP337-500 0.05%
UV vis Spectrophotometer Agilent  Cary 60 UV-Vis
Peptide name Peptide sequence HPLC-purity Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42) HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG
92.14% Conforms
Mouse Stra6 (40) SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK
90.84% Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42) HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG
0.92% Conforms

参考文献

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記事を引用
Radhakrishnan, R., Lor, A., Li, D., Mudaliar, D., Lobo, G. P. Methodology for Studying Interactions of Vitamin A Membrane Receptors and Opsin Protein with their Ligands in Generating the Retinylidene Protein. J. Vis. Exp. (212), e67036, doi:10.3791/67036 (2024).

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