Summary

Metodología para el estudio de las interacciones de los receptores de membrana de vitamina A y la proteína opsina con sus ligandos en la generación de la proteína retinilideno

Published: October 04, 2024
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Summary

Aquí, describimos dos métodos cuantitativos para estudiar las interacciones proteína-ligando de los receptores de membrana de vitamina A y la opsina fotorreceptora con sus respectivos ligandos fisiológicos.

Abstract

La distribución de la vitamina A en la dieta/retinol todo-trans (ROL) en todo el cuerpo es fundamental para mantener la función de los retinoides en los tejidos periféricos y generar la proteína retinilideno para la función visual. RBP4-ROL es el complejo de ROL con la proteína 4 de unión al retinol (RBP4), que está presente en la sangre. Dos receptores de membrana, el receptor 2 de la proteína de unión al retinol 4 (RBPR2) en el hígado y el receptor STimulado por el ácido retinoico 6 retinol (STRA6) en el ojo, se unen a la RBP4 circulatoria y este mecanismo es fundamental para internalizar el ROL en las células. El establecimiento de métodos para investigar la cinética receptor-ligando es esencial para comprender la función fisiológica de los receptores de vitamina A para la homeostasis de los retinoides. Mediante ensayos de resonancia de plasmón de superficie (SPR), podemos analizar las afinidades de unión y los parámetros cinéticos de los receptores de membrana de la vitamina A con su ligando fisiológico RBP4.

Estas metodologías pueden revelar nueva información estructural y bioquímica de los motivos de unión a RBP4 en RBPR2 y STRA6, que son críticos para comprender los estados patológicos de la deficiencia de vitamina A. En el ojo, el ROL internalizado se metaboliza a 11-cis retinal, el cromóforo visual que se une a la opsina en los fotorreceptores para formar la proteína retinilideno, rodopsina. La absorbancia de la luz provoca la isomerización cis-trans del retinal 11-cis, induciendo cambios conformacionales en la rodopsina y la posterior activación de la cascada de fototransducción. La disminución de las concentraciones séricas y el ROL ocular pueden afectar la formación de la proteína retinilideno, que a su vez puede causar una mala localización de la rodopsina, acumulación de opsina de apoproteína, ceguera nocturna y degeneración del segmento externo de los fotorreceptores, lo que conduce a la retinosis pigmentaria o amaurosis congénita de Leber.

Por lo tanto, las metodologías espectrofotométricas para cuantificar el complejo retiniano opsina-11-cis del receptor acoplado a proteína G en la retina son críticas para comprender los mecanismos de degeneración de las células de la retina en los estados patológicos mencionados anteriormente. Con estas metodologías integrales, los investigadores podrán evaluar mejor el suministro de vitamina A en la dieta para mantener la homeostasis sistémica y ocular de los retinoides, que es fundamental para generar y mantener las concentraciones de proteína retinilideno en los fotorreceptores, que es fundamental para mantener la función visual en los seres humanos.

Introduction

La vitamina A / retinol todo-trans / ROL es un componente importante que desempeña un papel en la función visual 1,2. El cromóforo 11-cis retinal, un metabolito de la vitamina A de la dieta, se une a la opsina del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) para generar la proteína retinilideno, rodopsina, en los fotorreceptores. Cuando la luz incide sobre el ojo, la configuración de la rodopsina sufre un cambio fundamental a través de la conversión de su componente 11-cis-retinal en el todo-trans-retinal. Este cambio de configuración desencadena una cascada de fototransducción dentro de los fotorreceptores de los bastones, convirtiendo la luz en una señal eléctrica, que se transmite a la corteza visual en el cerebro a través del nervio óptico 3,4,5,6,7,8,9,10 . La disminución de las concentraciones séricas y el ROL ocular pueden afectar la formación de la proteína retinilideno, lo que a su vez causa la mala localización de la opsina, la acumulación de apoproteínas opsinas, la ceguera nocturna y la degeneración del sistema operativo de los fotorreceptores, lo que conduce a la retinosis pigmentaria o amaurosis congénita de Leber, que puede causar ceguera 3,10.

El retinol totalmente trans es la forma de transporte fundamental de la vitamina A en la dieta y es la fuente de la que se derivan todos los retinoides funcionales y los metabolitos de la vitamina A en la dieta. El hígado es el órgano principal para el almacenamiento de vitamina A en la dieta. El retinol hepático se transporta a través del suero en forma de complejo con la proteína 4 de unión al retinol (RBP4). La RBP4, expresada principalmente en el hígado, forma un holocomplejo con el sustrato de retinol y la transtiretina (TTR), que entra en la circulación 11,12,13,14,15,16,17. El informe de un receptor de superficie celular para RBP4 en la década de 1970 condujo a la hipótesis de que las proteínas transportadoras de membrana ayudaban al transporte de retinoides dentro y fuera de las células. El receptor de la superficie celular para el retinol unido a RBP4 (RBP4-ROL) se identificó como estimulado por el ácido retinoico 6 retinol (STRA6) en el epitelio pigmentario de la retina (EPR) del ojo. STRA6 se une al complejo holo-RBP4 circulatorio y transporta el retinol unido a RBP4 a través del EPR para ser utilizado por los fotorreceptores18,19. Las mutaciones en STRA6 pueden conducir a una miríada de enfermedades y fenotipos asociados con concentraciones reducidas de ROL ocular. Las mutaciones en STRA6 durante el desarrollo pueden provocar anoftalmia, microftalmia y otros síntomas no oculares que se superponen con los fenotipos asociados con el síndrome de Matthew-Wood 20,21,22,23,24,25,26,27. La STRA6 se expresa en diferentes órganos y tejidos, como el EPR del ojo, pero no en todos los tejidos26,27. Aunque el sitio principal de almacenamiento de retinoides es el hígado, STRA6 no se expresa en el hígado.

Alapatt y sus colegas descubrieron que el receptor 2 de la proteína de unión al retinol 4 (RBPR2) se unió a RBP4 con alta afinidad y fue responsable de la absorción de retinol unido a RBP4 en el hígado, similar a STRA6 en el RPE28. Se ha reportado que RBPR2 comparte homología estructural con STRA6 29,30,31. Se propone que RBP4 se une a los residuos S294, Y295 y L296 en RBPR2, un dominio de unión a aminoácidos parcialmente conservado entre RBPR2 y STRA6 29,30,31. A partir de estos estudios, se propone que los receptores de membrana de la vitamina A, como STRA6 y RBPR2, que contienen uno o más residuos/dominios de unión extracelular, interactúan con el RBP4-ROL circulatorio. Los receptores de membrana, por lo tanto, desempeñan un papel importante en la unión del receptor a RBP4 circulatorio para la internalización de ROL en tejidos diana, como el hígado y el ojo.

En la primera parte de este estudio, utilizamos la Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) para investigar la interacción de dos receptores de membrana de vitamina A (RBPR2 y STRA6) con su ligando fisiológico RBP431. Las afinidades de unión y la cinética de asociación/disociación de la proteína a los complejos de ligandos se pueden medir en tiempo real mediante el uso de SPR. Esta metodología tuvo como objetivo proporcionar información cinética, estructural y bioquímica crítica sobre los motivos de unión a RBP4 en RBPR2 y STRA6, que son críticos para comprender los estados patológicos de la deficiencia de vitamina A31,32. Como se mencionó anteriormente, el ROL circulatorio se internaliza en el EPR a través de STRA6 para generar el cromóforo 11-cis retinal, que se une a la opsina para generar la proteína retinilideno, rodopsina, en los fotorreceptores33. Utilizamos metodologías de espectrofotometría para cuantificar la GPCR-opsina y su ligando 11-cis retinal complex en lisados de retina murinos, lo cual es crítico para comprender los mecanismos de la proteína retinilideno reducida, rodopsina, en los estados patológicos oculares de Retinitis Pigmentosa o Amaurosis Congénita de Leber34. En general, estos protocolos se pueden aplicar para estudiar in vitro las consecuencias fisiológicas de los mutantes RBP4, STRA6 o RBPR2 en la influencia de la homeostasis sistémica y ocular de la vitamina A sistémica y ocular o el impacto de las proteínas mutantes de la rodopsina o del ciclo de los retinoides en la función visual35,36.

Protocol

1. Metodología de resonancia de plasmón de superficie (SPR) Preparación y purificación de la proteína RBP4 de ratónDiseñe cebadores para generar ADNc de ratón RBP4 (msRBP4) de longitud completa (Secuencia de referencia del NCBI: NM_001159487.1). Clone el ADNc msRBP4 en un vector de expresión resistente a la kanamicina pET28a His-tag y expréselo en células BL-21 DE3 (Tabla de materiales). Transform…

Representative Results

Se describen métodos cuantitativos para estudiar las interacciones proteína-ligando de los receptores de membrana de vitamina A y la opsina de los fotorreceptores con sus respectivos ligandos fisiológicos. La RBP4 recombinante de ratón debe expresarse en E. coli y la proteína purificada debe utilizarse como ligando conjugado en un chip SPR. El RBPR2, STRA6 y el mutante S294A RBPR2 “SYL motif RBP4 interacting extracellular site” sintetizados químicamente de un péptido de ~…

Discussion

Pasos críticos en el protocolo
Metodología SPR
Modelado in silico y análisis de acoplamiento: La estructura predicha de RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) y STRA6, y la estructura conocida para la base de datos MSRBP 4 PDB (RSCB PDB ID: 2wqa), deben utilizarse para el estudio de acoplamiento29,31. Además, se deben utilizar métodos in vitro (cult…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a la Dra. Beata Jastrzebska, Ph.D. (Departamento de Farmacología, Universidad Case Western Reserve, OH) por su consejo sobre el protocolo de absorción de rodopsina. Este trabajo fue apoyado por una subvención de los NIH-NEI (EY030889 y 3R01EY030889-03S1) y, en parte, por los fondos iniciales de la Universidad de Minnesota para G.P.L.

Materials

2-D Quant Kit Cytiva 80648356
Amine Coupling Kit Cytiva BR100050
Biacore evaluation software Biacore S200 Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5 Cytiva BR100530
Bis tris propane Sigma B6755-25G 20 mM
BL21 DE3 competent cells Thermo Scientific EC0114
CD spectrophotometer Jasco J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL Fisher Bioreagents BP381-1
GraphPad Prism  Model fitting, data analysis
LB broth Fisher Bioreagents BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM) EMD Millipore 324355-1GM 2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector  Addgene 69864-3
Plasmid purification kit Qiagen 27106
Rho1D4 MagBeads CubeBiotech 33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette Thermo Scientific 66810
Tween20 Fisher Bioreagents BP337-500 0.05%
UV vis Spectrophotometer Agilent  Cary 60 UV-Vis
Peptide name Peptide sequence HPLC-purity Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42) HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG
92.14% Conforms
Mouse Stra6 (40) SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK
90.84% Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42) HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG
0.92% Conforms

Referencias

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Radhakrishnan, R., Lor, A., Li, D., Mudaliar, D., Lobo, G. P. Methodology for Studying Interactions of Vitamin A Membrane Receptors and Opsin Protein with their Ligands in Generating the Retinylidene Protein. J. Vis. Exp. (212), e67036, doi:10.3791/67036 (2024).

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