Summary

Méthodologie d’étude des interactions des récepteurs membranaires de la vitamine A et de la protéine opsine avec leurs ligands dans la génération de la protéine rétinylidène

Published: October 04, 2024
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Summary

Ici, nous décrivons deux méthodes quantitatives pour étudier les interactions protéine-ligand des récepteurs membranaires de la vitamine A et de l’opsine photorécepteur avec leurs ligands physiologiques respectifs.

Abstract

La distribution de la vitamine A/rétinol tout-trans (ROL) alimentaire dans tout le corps est essentielle pour maintenir la fonction rétinoïde dans les tissus périphériques et générer la protéine rétinylidène pour la fonction visuelle. RBP4-ROL est le complexe de ROL avec la protéine de liaison au rétinol 4 (RBP4), qui est présente dans le sang. Deux récepteurs membranaires, le récepteur 2 de la protéine de liaison au rétinol 4 (RBPR2) dans le foie et le récepteur STimilé par l’acide rétinoïque 6 (STRA6) dans l’œil, se lient à RBP4 circulatoire et ce mécanisme est essentiel à l’internalisation du ROL dans les cellules. L’établissement de méthodes pour étudier la cinétique récepteur-ligand est essentiel pour comprendre la fonction physiologique des récepteurs de la vitamine A pour l’homéostasie rétinoïde. À l’aide de tests de résonance plasmonique de surface (SPR), nous pouvons analyser les affinités de liaison et les paramètres cinétiques des récepteurs membranaires de la vitamine A avec son ligand physiologique RBP4.

Ces méthodologies peuvent révéler de nouvelles informations structurales et biochimiques sur les motifs de liaison à RBP4 dans RBPR2 et STRA6, qui sont essentiels pour comprendre les états pathologiques de carence en vitamine A. Dans l’œil, le ROL internalisé est métabolisé en 11-cis rétinien, le chromophore visuel qui se lie à l’opsine dans les photorécepteurs pour former la protéine rétinylidène, la rhodopsine. L’absorbance de la lumière provoque l’isomérisation cis-trans de la rétine 11-cis, induisant des changements conformationnels de la rhodopsine et l’activation ultérieure de la cascade de phototransduction. Une diminution des concentrations sériques et oculaires peut avoir un impact sur la formation de la protéine rétinylidène, ce qui peut entraîner une mauvaise localisation de la rhodopsine, une accumulation d’apoprotéine opsine, une cécité nocturne et une dégénérescence du segment externe des photorécepteurs, entraînant une rétinite pigmentaire ou une amaurose congénitale de Leber.

Par conséquent, les méthodologies spectrophotométriques permettant de quantifier le complexe rétinien opsine-11-cis du récepteur couplé aux protéines G dans la rétine sont essentielles pour comprendre les mécanismes de dégénérescence des cellules rétiniennes dans les états pathologiques mentionnés ci-dessus. Grâce à ces méthodologies complètes, les chercheurs seront en mesure de mieux évaluer l’apport alimentaire en vitamine A dans le maintien de l’homéostasie rétinoïde systémique et oculaire, qui est essentielle à la génération et au maintien des concentrations de protéines de rétinylidène dans les photorécepteurs, qui est essentielle au maintien de la fonction visuelle chez les humains.

Introduction

La vitamine A/rétinol tout-trans/ROL obtenue par voie alimentaire est un composant important jouant un rôle dans la fonction visuelle 1,2. Le chromophore 11-cis rétinal, un métabolite de la vitamine A alimentaire, se lie à l’opsine du récepteur couplé aux protéines G (RCPG) pour générer la protéine rétinylidène, la rhodopsine, dans les photorécepteurs. Lorsque la lumière tombe sur l’œil, la configuration de la rhodopsine subit un changement fondamental via la conversion de sa composante 11-cis-rétinienne en tout-trans-rétinienne. Ce changement de configuration déclenche une cascade de phototransduction dans les photorécepteurs à bâtonnets, convertissant la lumière en un signal électrique, qui est transmis au cortex visuel du cerveau via le nerf optique 3,4,5,6,7,8,9,10 . Une diminution des concentrations sériques et oculaires peut avoir un impact sur la formation de la protéine rétinylidène, ce qui provoque à son tour une mauvaise localisation de l’opsine, une accumulation d’opsine apoprotéique, une cécité nocturne et une dégénérescence des photorécepteurs OS, conduisant à une rétinite pigmentaire ou à une amaurose congénitale de Leber, qui peut provoquer la cécité 3,10.

Le rétinol tout-trans est la forme de transport fondamentale de la vitamine A alimentaire, et c’est la source à partir de laquelle tous les rétinoïdes fonctionnels et les métabolites de la vitamine A alimentaire sont dérivés. Le foie sert d’organe principal pour le stockage de la vitamine A alimentaire. Le rétinol hépatique est transporté par le sérum sous forme de complexe avec la protéine de liaison au rétinol 4 (RBP4). RBP4, principalement exprimé dans le foie, forme un holo-complexe avec le substrat du rétinol et la transthyrétine (TTR), qui entre dans la circulation 11,12,13,14,15,16,17. Dans les années 1970, l’apparition d’un récepteur de surface cellulaire pour RBP4 a conduit à l’hypothèse que les protéines de transport membranaire aident au transport des rétinoïdes à l’intérieur et à l’extérieur des cellules. Le récepteur de surface cellulaire du rétinol lié à RBP4 (RBP4-ROL) a été identifié comme étant STimulé par l’acide rétinoïque 6 rétinol (STRA6) dans l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) de l’œil. STRA6 se lie au complexe holo-RBP4 circulatoire et transporte le rétinol lié à RBP4 à travers l’EPR pour être utilisé par les photorécepteurs18,19. Les mutations de STRA6 peuvent entraîner une myriade de maladies et de phénotypes associés à des concentrations oculaires réduites de ROL. Les mutations STRA6 au cours du développement peuvent entraîner une anophtalmie, une microphtalmie et d’autres symptômes non oculaires qui se chevauchent avec les phénotypes associés au syndrome de Matthew-Wood 20,21,22,23,24,25,26,27. STRA6 est exprimé dans différents organes et tissus, tels que l’EPR dans l’œil, mais pas dans tous les tissus26,27. Bien que le principal site de stockage des rétinoïdes soit le foie, STRA6 n’est pas exprimé dans le foie.

Alapatt et ses collègues ont découvert que le récepteur 2 de la protéine de liaison au rétinol 4 (RBPR2) liait RBP4 avec une grande affinité et était responsable de l’absorption du rétinol lié à RBP4 dans le foie, similaire à STRA6 dans le RPE28. RBPR2 a été signalé comme partageant une homologie structurale avec STRA6 29,30,31. Il est proposé que RBP4 se lie aux résidus S294, Y295 et L296 sur RBPR2, un domaine de liaison aux acides aminés partiellement conservé entre RBPR2 et STRA6 ainsi que 29,30,31. D’après ces études, il est proposé que les récepteurs membranaires de la vitamine A tels que STRA6 et RBPR2, qui contiennent un ou plusieurs résidus/domaines de liaison extracellulaires, interagissent avec RBP4-ROL circulatoire. Les récepteurs membranaires jouent donc un rôle important dans la liaison des récepteurs à RBP4 circulatoire pour l’internalisation de ROL dans les tissus cibles, tels que le foie et l’œil.

Dans la première partie de cette étude, nous avons utilisé la résonance plasmonique de surface (SPR) pour étudier l’interaction de deux récepteurs membranaires de la vitamine A (RBPR2 et STRA6) avec leur ligand physiologique RBP431. Les affinités de liaison et la cinétique d’association/dissociation des complexes protéiques et ligands peuvent être mesurées en temps réel à l’aide de la SPR. Cette méthodologie visait à fournir des informations cinétiques, structurelles et biochimiques critiques sur les motifs de liaison à RBP4 dans RBPR2 et STRA6, qui sont essentiels pour comprendre les états pathologiques de carence en vitamine A31,32. Comme mentionné ci-dessus, le ROL circulatoire est internalisé dans l’EPR via STRA6 pour générer le chromophore 11-cis rétinal, qui se lie à l’opsine pour générer la protéine rétinylidène, la rhodopsine, dans les photorécepteurs33. Nous avons utilisé des méthodologies de spectrophotométrie pour quantifier le GPCR-opsine et son ligand 11-cis complexe rétinien dans les lysats rétiniens murins, ce qui est essentiel pour comprendre les mécanismes de la protéine rétinylidène réduite, la rhodopsine, dans la rétinite pigmentaire ou l’amaurose congénitale de Leber34. En général, ces protocoles peuvent être appliqués pour étudier in vitro les conséquences physiologiques des mutants RBP4, STRA6 ou RBPR2 dans l’influence de l’homéostasie systémique et oculaire de la vitamine A ou l’impact des protéines mutantes du cycle de la rhodopsine ou des rétinoïdes sur la fonction visuelle35,36.

Protocol

1. Méthodologie de la résonance plasmonique de surface (SPR) Préparation et purification de la protéine RBP4 de sourisConcevez des amorces pour générer de l’ADNc RBP4 (msRBP4) de souris pleine longueur (séquence de référence NCBI : NM_001159487.1). Clonez l’ADNc msRBP4 dans un vecteur d’expression résistant à la kanamycine pET28a His-tag et exprimez-le dans les cellules BL-21 DE3 (Table des matériaux)…

Representative Results

Des méthodes quantitatives sont décrites pour étudier les interactions protéine-ligand des récepteurs membranaires de la vitamine A et de l’opsine photorécepteur avec leurs ligands physiologiques respectifs. La souris recombinante RBP4 doit être exprimée dans E. coli et la protéine purifiée doit être utilisée comme ligand conjugué sur une puce SPR. Le RBPR2, STRA6 et le mutant S294A RBPR2 « SYL motif RBP4 interagissant avec le site extracellulaire » synthétis…

Discussion

Étapes critiques du protocole
Méthodologie SPR
Modélisation in silico et analyse d’amarrage : La structure prédite de RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) et STRA6, ainsi que la structure connue de la base de données PDB msRBP4 (RSCB PDB ID : 2wqa), doivent être utilisées pour l’étude d’amarrage29,31. De plus, des méthodes in vitro (cult…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient la Dre Beata Jastrzebska, Ph.D. (Département de pharmacologie, Case Western Reserve University, OH) pour ses conseils sur le protocole d’absorption de la rhodopsine. Ces travaux ont été financés par une subvention NIH-NEI (EY030889 et 3R01EY030889-03S1) et, en partie, par les fonds de démarrage de l’Université du Minnesota versés à G.P.L.

Materials

2-D Quant Kit Cytiva 80648356
Amine Coupling Kit Cytiva BR100050
Biacore evaluation software Biacore S200 Version 1.1
Biacore Sensor chip CM5 Cytiva BR100530
Bis tris propane Sigma B6755-25G 20 mM
BL21 DE3 competent cells Thermo Scientific EC0114
CD spectrophotometer Jasco J-815 Spectropolarimeter
Glycine HCL Fisher Bioreagents BP381-1
GraphPad Prism  Model fitting, data analysis
LB broth Fisher Bioreagents BP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM) EMD Millipore 324355-1GM 2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector  Addgene 69864-3
Plasmid purification kit Qiagen 27106
Rho1D4 MagBeads CubeBiotech 33299
Slide-A_Lyzer 10K dialysis cassette Thermo Scientific 66810
Tween20 Fisher Bioreagents BP337-500 0.05%
UV vis Spectrophotometer Agilent  Cary 60 UV-Vis
Peptide name Peptide sequence HPLC-purity Mass Spec
Mouse Rbpr2 (42) HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG
92.14% Conforms
Mouse Stra6 (40) SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK
90.84% Conforms
Mouse Rbpr2 mutant S294A (42) HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG
0.92% Conforms

References

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Citer Cet Article
Radhakrishnan, R., Lor, A., Li, D., Mudaliar, D., Lobo, G. P. Methodology for Studying Interactions of Vitamin A Membrane Receptors and Opsin Protein with their Ligands in Generating the Retinylidene Protein. J. Vis. Exp. (212), e67036, doi:10.3791/67036 (2024).

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