Lipid Nanopartikül (LNP) Formülasyon Optimizasyonu için Tasarlanmış Karışım-Proses Deneyleri ve Kendi Kendini Doğrulayan Topluluk Modelleri (SVEM) Kullanarak Bir İş Akışı

İn vivo gen dağıtım sistemleri için lipid nanopartikül (LNP) formülasyonları genellikle iyonlaştırılabilir, yardımcı ve PEG lipitleri ^1,2,3 kategorilerinden dört bileşen lipit içerir. Bu lipitlerin tek başına veya diğer karışım dışı faktörlerle eşzamanlı olarak çalışılıp çalışılmadığına bakılmaksızın, bu formülasyonlar için yapılan deneyler “karışım” tasarımları gerektirir, çünkü – aday bir formülasyon göz önüne alındığında – lipitlerden herhangi birinin oranının arttırılması veya azaltılması zorunlu olarak diğer üç lipitin oranlarının toplamında karşılık gelen bir azalmaya veya artışa yol açar.

Örnek olarak, şu anda kriter olarak ele alınacak bir set tarifi kullanan bir LNP formülasyonunu optimize ettiğimiz varsayılmaktadır. Amaç, LNP’nin gücünü en üst düzeye çıkarırken, ikincil olarak ortalama parçacık boyutunu en aza indirmeyi amaçlamaktadır. Deneyde değişen çalışma faktörleri, dört kurucu lipitin (iyonize edilebilir, kolesterol, DOPE, PEG) molar oranları, N: P oranı, akış hızı ve iyonize edilebilir lipit tipidir. İyonlaştırılabilir ve yardımcı lipitlerin (kolesterol dahil), bu çizimde% 1-5 arasında değişecek olan PEG’den% 10-60 daha geniş bir molar oran aralığında değişmesine izin verilir. Kıyaslama formülasyonu tarifi, diğer faktörlerin aralıkları ve yuvarlama ayrıntı düzeyleri Ek Dosya 1’de belirtilmiştir. Bu örnek için, bilim adamları tek bir günde 23 çalışma (benzersiz parçacık grupları) gerçekleştirebilirler ve minimum gereksinimleri karşılıyorsa bunu örneklem büyüklüğü olarak kullanmak isterler. Bu denemenin simülasyon sonuçları Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3’te sağlanmıştır.

Rampado ve Peer⁴, nanopartikül tabanlı ilaç dağıtım sistemlerinin optimizasyonu için tasarlanmış deneyler konusunda yeni bir inceleme makalesi yayınladı. Kauffman ve ^ark.5, kesirli faktöriyel ve kesin tarama tasarımları kullanarak LNP optimizasyon çalışmalarını ele almıştır⁶; Bununla birlikte, bu tür tasarımlar, verimsiz “gevşek değişkenler”7 kullanımına başvurmadan bir karışım kısıtlamasına uyum sağlayamaz ve tipik olarak karışım faktörleri mevcut olduğunda kullanılmaz ^7,8. Bunun yerine, bir karışım kısıtlaması içerebilen “optimal tasarımlar” geleneksel olarak karışım-proses deneyleri için kullanılır⁹. Bu tasarımlar, çalışma faktörlerinin kullanıcı tarafından belirlenen bir işlevini hedefler ve yalnızca bu işlev çalışma faktörleri ve yanıtlar arasındaki gerçek ilişkiyi yakalarsa (bir dizi olası duyudan birinde) optimaldir. Metinde “optimal tasarımlar” ve “optimal formülasyon adayları” arasında bir ayrım olduğunu ve ikincisinin istatistiksel bir model tarafından tanımlanan en iyi formülasyonlara atıfta bulunduğunu unutmayın. Optimum tasarımlar, karışım-proses deneyleri için üç ana dezavantajla birlikte gelir. İlk olarak, bilim adamı hedef modeli belirlerken çalışma faktörlerinin etkileşimini öngöremezse, ortaya çıkan model önyargılı olacak ve daha düşük aday formülasyonlar üretebilecektir. İkincisi, optimum tasarımlar, koşuların çoğunu faktör alanının dış sınırına yerleştirir. LNP çalışmalarında, parçacıklar lipit veya proses ayarlarının herhangi bir uç noktasında doğru şekilde oluşmazsa, bu çok sayıda kayıp çalışmaya yol açabilir. Üçüncüsü, bilim adamları genellikle tepki yüzeyinin modelden bağımsız bir duygusunu kazanmak ve süreci doğrudan faktör uzayının daha önce keşfedilmemiş bölgelerinde gözlemlemek için faktör uzayının iç kısmında deneysel çalışmalar yapmayı tercih ederler.

Alternatif bir tasarım ilkesi, (karışım kısıtlamalı) faktör alanının yaklaşık olarak eşit bir kapsamını boşluk doldurma tasarımı¹⁰ ile hedeflemektir. Bu tasarımlar, optimal tasarımlara göre bazı deneysel verimlilikleri feda eder⁹ (tüm faktör alanının geçerli formülasyonlara yol açtığını varsayarsak), ancak bu uygulamada yararlı olan bir takasta çeşitli faydalar sunar. Boşluk doldurma tasarımı, tepki yüzeyinin yapısı hakkında herhangi bir a priori varsayımda bulunmaz; Bu, çalışma faktörleri arasındaki beklenmedik ilişkileri yakalama esnekliği sağlar. Bu aynı zamanda tasarım oluşturmayı da kolaylaştırır, çünkü istenen çalıştırma boyutu ayarlanırken hangi regresyon terimlerinin ekleneceği veya kaldırılacağı konusunda karar vermeyi gerektirmez. Bazı tasarım noktaları (tarifler) başarısız formülasyonlara yol açtığında, boşluk doldurma tasarımları, çalışma faktörleri üzerindeki başarısızlık sınırını modellemeyi mümkün kılarken, aynı zamanda başarılı faktör kombinasyonları üzerindeki çalışma yanıtları için istatistiksel modelleri de destekler. Son olarak, faktör uzayının iç kapsama alanı, tepki yüzeyinin modelden bağımsız grafiksel olarak araştırılmasına izin verir.

Bir karışım-işlem deneyinin karışım faktörü alt alanını görselleştirmek için, özel üçgen “üçlü grafikler” kullanılır. Şekil 1 bu kullanımı motive eder: üç bileşenin her birinin 0 ila 1 arasında değişmesine izin verilen noktalar küpünde, bileşenlerin toplamının 1’e eşit olduğu bir kısıtlamayı karşılayan noktalar kırmızı renkle vurgulanır. Üç bileşen üzerindeki karışım kısıtlaması, uygulanabilir faktör alanını bir üçgene indirger. Dört karışım bileşeni içeren LNP uygulamalarında, diğer lipitlerin toplamını temsil eden bir “Diğerleri” eksenine karşı bir seferde iki lipit çizerek faktör uzayını temsil etmek için altı farklı üçlü grafik üretiyoruz.

Resim 1: Üçgen faktör bölgeleri. Küp içindeki boşluk doldurma grafiğinde, küçük gri noktalar karışım kısıtlamasıyla tutarsız formülasyonları temsil eder. Daha büyük kırmızı noktalar, küpün içine yazılmış bir üçgen üzerinde bulunur ve karışım kısıtlamasının karşılandığı formülasyonları temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Lipid karışım faktörlerine ek olarak, genellikle N: P oranı, tampon konsantrasyonu veya akış hızı gibi bir veya daha fazla sürekli proses faktörü vardır. İyonlaştırılabilir lipit tipi, yardımcı lipit tipi veya tampon tipi gibi kategorik faktörler mevcut olabilir. Amaç, bir miktar potens ölçüsünü en üst düzeye çıkaran ve / veya partikül boyutunu ve PDI’yı (polidispersite indeksi) en aza indirmek, yüzde kapsüllemeyi en üst düzeye çıkarmak ve vücut ağırlığı kaybı gibi yan etkileri en aza indirmek gibi fizyokimyasal özellikleri geliştiren bir formülasyon (lipitlerin ve proses faktörleri için ayarların bir karışımı) bulmaktır. in vivo çalışmalar. Makul bir kıyaslama tarifinden başlarken bile, genetik yükteki bir değişiklik göz önüne alındığında veya proses faktörlerindeki veya lipit tiplerindeki değişiklikler göz önüne alındığında yeniden optimizasyona ilgi duyulabilir.

Cornell⁷ , karışım ve karışım-proses deneylerinin istatistiksel yönleri hakkında kesin bir metin sunarken, Myers ve ^ark.9 , optimizasyon için en alakalı karışım tasarımı ve analiz konularının mükemmel bir özetini sunmaktadır. Bununla birlikte, bu çalışmalar bilim adamlarını istatistiksel ayrıntılarla ve özel terminolojiyle aşırı yükleyebilir. Deneylerin tasarımı ve analizi için modern yazılım, ilgili teoriye başvurmak zorunda kalmadan çoğu LNP optimizasyon problemini yeterince destekleyecek sağlam bir çözüm sunar. Daha karmaşık veya yüksek öncelikli çalışmalar hala bir istatistikçi ile işbirliğinden faydalanacak ve alan doldurma tasarımları yerine optimal kullanabilse de, amacımız bilim adamlarının konfor seviyesini iyileştirmek ve LNP formülasyonlarının optimizasyonunu teşvik etmektir. verimsiz bir kerede bir faktörlü (OFAT) test¹¹ veya sadece spesifikasyonları karşılayan ilk formülasyona razı olmadan.

Bu makalede, genel bir LNP formülasyon problemini optimize etmek için istatistiksel yazılımı kullanan, tasarım ve analiz sorunlarını karşılaşacakları sırayla ele alan bir iş akışı sunulmaktadır. Aslında, yöntem genel optimizasyon problemleri için işe yarayacaktır ve LNP’lerle sınırlı değildir. Yol boyunca, ortaya çıkan birkaç yaygın soru ele alınmakta ve deneyime ve simülasyon sonuçlarına dayanan öneriler sağlanmaktadır¹². Yakın zamanda geliştirilen kendi kendini doğrulayan topluluk modelleri (SVEM)¹³ çerçevesi, karışım-proses deneylerinden elde edilen sonuçları analiz etmek için aksi takdirde kırılgan olan yaklaşımı büyük ölçüde geliştirmiştir ve bu yaklaşımı formülasyon optimizasyonu için basitleştirilmiş bir strateji sağlamak için kullanıyoruz. İş akışı, diğer yazılım paketleri kullanılarak takip edilebilecek genel bir şekilde inşa edilmiş olsa da, JMP 17 Pro, karışım-süreç deneylerinin aksi takdirde gizemli analizini basitleştirmek için gerekli olduğunu bulduğumuz grafiksel özet araçlarıyla birlikte SVEM’i sunma konusunda benzersizdir. Sonuç olarak, JMP’ye özgü talimatlar da protokolde sağlanmaktadır.

SVEM, geleneksel yaklaşımla aynı doğrusal regresyon modeli temelini kullanır, ancak ileri seçim veya cezalı seçim (Lasso) temel yaklaşımını kullanarak aday etkilerin “tam modeline” uyması gereken sıkıcı değişikliklerden kaçınmamızı sağlar. Ek olarak, SVEM, verilerde görünen gürültüyü (proses artı analitik varyans) dahil etme potansiyelini en aza indiren gelişmiş bir “azaltılmış model” uyumu sağlar. 13,14,15,16,17,18 modelindeki her bir çalıştırmanın göreceli öneminin tekrar tekrar ağırlıklandırılmasından kaynaklanan tahmin edilen modellerin ortalamasını alarak çalışır. SVEM, karışım-proses deneylerinin modellenmesi için hem geleneksel tek atışlı regresyondan daha kolay uygulanabilir hem de daha kaliteli optimal formülasyon adayları^12,13 sağlayan bir çerçeve sağlar. SVEM’in matematiksel detayları bu makalenin kapsamı dışındadır ve ilgili literatür taramasının ötesinde üstünkörü bir özet bile bu uygulamadaki ana avantajından uzaklaşacaktır: uygulayıcılar için basit, sağlam ve doğru bir tıkla-çalıştır prosedürüne izin verir.

Sunulan iş akışı, farmasötik geliştirmeye yönelik Tasarıma Göre Kalite (QbD)¹⁹ yaklaşımı²⁰ ile tutarlıdır. Çalışmanın sonucu, malzeme niteliklerini ve proses parametrelerini kritik kalite niteliklerine (CQA’lar) bağlayan fonksiyonel ilişkinin anlaşılması ^olacaktır21. Daniel ve ^ark.22 , özellikle RNA platformu üretimi için bir QbD çerçevesi kullanmayı tartışıyor: iş akışımız bu çerçevede bir araç olarak kullanılabilir.