Un flux de travail pour l’optimisation de la formulation de nanoparticules lipidiques (LNP) à l’aide d’expériences de processus de mélange conçues et de modèles d’ensemble auto-validés (SVEM)

Les formulations de nanoparticules lipidiques (LNP) pour les systèmes d’administration de gènes in vivo impliquent généralement quatre lipides constitutifs des catégories des lipides ionisables, auxiliaires et PEG ^1,2,3. Que ces lipides soient étudiés seuls ou simultanément avec d’autres facteurs autres que le mélange, les expériences pour ces formulations nécessitent des conceptions de « mélange » parce que – étant donné une formulation candidate – l’augmentation ou la diminution du rapport de l’un quelconque des lipides entraîne nécessairement une diminution ou une augmentation correspondante de la somme des rapports des trois autres lipides.

À titre d’illustration, il est supposé que nous optimisons une formulation LNP qui utilise actuellement une recette définie qui sera traitée comme la référence. L’objectif est de maximiser la puissance du LNP tout en visant secondairement à minimiser la taille moyenne des particules. Les facteurs d’étude qui sont variés dans l’expérience sont les rapports molaires des quatre lipides constitutifs (ionisable, cholestérol, DOPE, PEG), le rapport N:P, le débit et le type de lipide ionisable. Les lipides ionisables et auxiliaires (y compris le cholestérol) peuvent varier sur une gamme plus large de rapports molaires, 10-60%, que le PEG, qui variera de 1 à 5% dans cette illustration. La recette de la formulation de référence et les fourchettes des autres facteurs et leur granularité arrondie sont spécifiées dans le dossier supplémentaire 1. Pour cet exemple, les scientifiques sont en mesure d’effectuer 23 essais (lots uniques de particules) en une seule journée et aimeraient l’utiliser comme taille d’échantillon s’il répond aux exigences minimales. Les résultats simulés de cette expérience sont fournis dans le dossier supplémentaire 2 et le dossier supplémentaire 3.

Rampado et Peer⁴ ont récemment publié un article de synthèse sur le sujet des expériences conçues pour l’optimisation des systèmes d’administration de médicaments à base de nanoparticules. Kauffman et ^coll.5 ont examiné les études d’optimisation de la LNP à l’aide de plans de criblage factoriels fractionnaires et définitifs⁶; Cependant, ces types de modèles ne peuvent pas s’adapter à une contrainte de mélange sans recourir à l’utilisation de « variables inutilisées »7 inefficaces et ne sont généralement pas utilisés lorsque des facteurs de mélange sont présents ^7,8. Au lieu de cela, les « plans optimaux » capables d’incorporer une contrainte de mélange sont traditionnellement utilisés pour les expériences de processus de mélange⁹. Ces plans ciblent une fonction spécifiée par l’utilisateur des facteurs d’étude et ne sont optimaux (dans l’un des nombreux sens possibles) que si cette fonction saisit la véritable relation entre les facteurs de l’étude et les réponses. Il convient de noter qu’il existe une distinction dans le texte entre les « plans optimaux » et les « formulations optimales candidates », ces dernières désignant les meilleures formulations identifiées par un modèle statistique. Les conceptions optimales présentent trois inconvénients principaux pour les expériences de processus de mélange. Premièrement, si le scientifique ne parvient pas à anticiper une interaction des facteurs d’étude lors de la spécification du modèle cible, le modèle résultant sera biaisé et peut produire des formulations candidates de qualité inférieure. Deuxièmement, les conceptions optimales placent la plupart des passages sur la limite extérieure de l’espace factoriel. Dans les études LNP, cela peut conduire à un grand nombre de séries perdues si les particules ne se forment pas correctement à des extrêmes des paramètres lipidiques ou de processus. Troisièmement, les scientifiques préfèrent souvent avoir des essais expérimentaux à l’intérieur de l’espace factoriel pour obtenir un sens indépendant du modèle de la surface de réponse et observer le processus directement dans des régions auparavant inexplorées de l’espace factoriel.

Un autre principe de conception consiste à cibler une couverture approximativement uniforme de l’espace factoriel (contraint par le mélange) avec un plan de remplissage^{d’espace 10}. Ces conceptions sacrifient une certaine efficacité expérimentale par rapport aux conceptions optimales⁹ (en supposant que l’espace factoriel entier conduit à des formulations valides) mais présentent plusieurs avantages dans un compromis qui sont utiles dans cette application. La conception de remplissage de l’espace ne fait pas d’hypothèses a priori sur la structure de la surface de réponse; Cela lui donne la souplesse nécessaire pour saisir les relations imprévues entre les facteurs de l’étude. Cela rationalise également la génération de conception, car il n’est pas nécessaire de prendre des décisions sur les termes de régression à ajouter ou à supprimer lorsque la taille d’exécution souhaitée est ajustée. Lorsque certains points de conception (recettes) conduisent à des formulations échouées, les plans de remplissage d’espace permettent de modéliser la limite de défaillance sur les facteurs de l’étude tout en soutenant les modèles statistiques pour les réponses à l’étude par rapport aux combinaisons de facteurs réussies. Enfin, la couverture intérieure de l’espace factoriel permet une exploration graphique indépendante du modèle de la surface de réponse.

Pour visualiser le sous-espace facteur de mélange d’une expérience de processus de mélange, des « tracés ternaires » triangulaires spécialisés sont utilisés. La figure 1 motive cet usage : dans le cube de points où trois ingrédients sont chacun autorisés à aller de 0 à 1, les points qui satisfont une contrainte que la somme des ingrédients est égale à 1 sont surlignés en rouge. La contrainte de mélange sur les trois ingrédients réduit l’espace factoriel possible à un triangle. Dans les applications LNP avec quatre ingrédients de mélange, nous produisons six diagrammes ternaires différents pour représenter l’espace factoriel en traçant deux lipides à la fois par rapport à un axe « Autres » qui représente la somme des autres lipides.

Figure 1 : Régions à facteurs triangulaires. Dans le diagramme de remplissage d’espace dans le cube, les petits points gris représentent des formulations qui ne sont pas cohérentes avec la contrainte de mélange. Les plus grands points rouges se trouvent sur un triangle inscrit dans le cube et représentent des formulations pour lesquelles la contrainte de mélange est satisfaite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En plus des facteurs de mélange lipidique, il existe souvent un ou plusieurs facteurs de processus continus tels que le rapport N:P, la concentration tampon ou le débit. Des facteurs catégoriques peuvent être présents, tels que le type de lipide ionisable, le type de lipide auxiliaire ou le type tampon. L’objectif est de trouver une formulation (un mélange de lipides et de paramètres pour les facteurs de processus) qui maximise une certaine mesure de la puissance et / ou améliore les caractéristiques physico-chimiques telles que la minimisation de la taille des particules et de l’indice de polydispersité, la maximisation du pourcentage d’encapsulation et la minimisation des effets secondaires – tels que la perte de poids corporel – dans les études in vivo . Même en partant d’une recette de référence raisonnable, il peut y avoir un intérêt à réoptimiser en fonction d’un changement dans la charge utile génétique ou en considérant des changements dans les facteurs de processus ou les types de lipides.

Cornell⁷ fournit un texte définitif sur les aspects statistiques des expériences de mélange et de processus de mélange, Myers et ^al.9 fournissant un excellent résumé des sujets de conception et d’analyse de mélange les plus pertinents pour l’optimisation. Cependant, ces travaux peuvent surcharger les scientifiques de détails statistiques et de terminologie spécialisée. Les logiciels modernes de conception et d’analyse d’expériences fournissent une solution robuste qui prendra suffisamment en charge la plupart des problèmes d’optimisation LNP sans avoir à faire appel à la théorie pertinente. Bien que les études plus complexes ou hautement prioritaires bénéficieront toujours de la collaboration avec un statisticien et puissent utiliser des conceptions optimales plutôt que de remplir l’espace, notre objectif est d’améliorer le niveau de confort des scientifiques et d’encourager l’optimisation des formulations LNP sans faire appel à des tests inefficaces à un facteur à la fois (OFAT)¹¹ ou simplement se contenter de la première formulation qui satisfait aux spécifications.

Dans cet article, un flux de travail est présenté qui utilise un logiciel statistique pour optimiser un problème générique de formulation LNP, en traitant les problèmes de conception et d’analyse dans l’ordre dans lequel ils seront rencontrés. En fait, la méthode fonctionnera pour les problèmes d’optimisation généraux et ne se limite pas aux LNP. En cours de route, plusieurs questions courantes qui se posent sont abordées et des recommandations sont fournies qui sont fondées sur l’expérience et les résultats^{de simulation 12}. Le cadre récemment développé de modèles d’ensemble auto-validés (SVEM)¹³ a grandement amélioré l’approche autrement fragile de l’analyse des résultats des expériences de mélange-processus, et nous utilisons cette approche pour fournir une stratégie simplifiée d’optimisation de la formulation. Bien que le flux de travail soit construit d’une manière générale qui peut être suivie à l’aide d’autres progiciels, JMP 17 Pro est unique en ce sens qu’il offre SVEM ainsi que les outils de résumé graphique que nous avons jugés nécessaires pour simplifier l’analyse autrement obscure des expériences de processus de mélange. Par conséquent, des instructions spécifiques à JMP sont également fournies dans le protocole.

SVEM utilise la même base de modèle de régression linéaire que l’approche traditionnelle, mais elle nous permet d’éviter les modifications fastidieuses qui sont nécessaires pour ajuster un « modèle complet » d’effets candidats en utilisant une approche de base de sélection directe ou de sélection pénalisée (Lasso). En outre, SVEM fournit un ajustement amélioré du « modèle réduit » qui minimise le potentiel d’incorporation du bruit (processus plus variance analytique) qui apparaît dans les données. Il fonctionne en faisant la moyenne des modèles prédits résultant de la repondération répétée de l’importance relative de chaque exécution dans le modèle 13,14,15,16,17,18. SVEM fournit un cadre pour la modélisation des expériences de processus de mélange qui est à la fois plus facile à mettre en œuvre que la régression traditionnelle en une seule injection et donne des candidats de formulation optimale de meilleure qualité^12,13. Les détails mathématiques de SVEM dépassent le cadre de cet article et même un résumé superficiel au-delà de la revue de littérature pertinente détournerait l’attention de son principal avantage dans cette application: il permet une procédure simple, robuste et précise click-to-run pour les praticiens.

Le flux de travail présenté est conforme à l’approche Quality by Design (QbD)¹⁹ du développement pharmaceutique²⁰. Le résultat de l’étude sera une compréhension de la relation fonctionnelle qui relie les attributs des matériaux et les paramètres de procédé aux attributs de qualité critiques (AQC)²¹. Daniel et ^al.22 discutent de l’utilisation d’un cadre QbD spécifiquement pour la production de plateformes d’ARN : notre flux de travail pourrait être utilisé comme un outil dans ce cadre.