Um fluxo de trabalho para otimização de formulação de nanopartículas lipídicas (LNP) usando experimentos de processo de mistura projetados e modelos de conjunto autovalidados (SVEM)

Formulações de nanopartículas lipídicas (LNP) para sistemas de liberação gênica in vivo geralmente envolvem quatro lipídios constituintes das categorias de lipídios ionizáveis, auxiliares e PEG ^1,2,3. Quer esses lipídios estejam sendo estudados isoladamente ou simultaneamente com outros fatores não-misturados, experimentos para essas formulações requerem desenhos de “mistura”, porque – dada uma formulação candidata – aumentar ou diminuir a proporção de qualquer um dos lipídios leva necessariamente a uma diminuição ou aumento correspondente na soma das proporções dos outros três lipídios.

Para ilustração, supõe-se que estamos otimizando uma formulação de LNP que atualmente usa uma receita definida que será tratada como referência. O objetivo é maximizar a potência do LNP e, secundariamente, minimizar o tamanho médio das partículas. Os fatores de estudo que são variados no experimento são as razões molares dos quatro lipídios constituintes (ionizável, colesterol, DOPE, PEG), a relação N:P, a taxa de fluxo e o tipo de lipídio ionizável. Os lipídios ionizáveis e auxiliares (incluindo o colesterol) podem variar em uma faixa mais ampla de razão molar, 10-60%, do que o PEG, que será variado de 1-5% nesta ilustração. A receita de formulação de referência e os intervalos dos outros fatores e sua granularidade de arredondamento são especificados no Arquivo Suplementar 1. Para este exemplo, os cientistas são capazes de realizar 23 corridas (lotes únicos de partículas) em um único dia e gostariam de usar isso como tamanho de amostra se atender aos requisitos mínimos. Os resultados simulados para este experimento são fornecidos no Arquivo Suplementar 2 e no Arquivo Suplementar 3.

Rampado e Peer⁴ publicaram um artigo de revisão recente sobre o tema de experimentos projetados para a otimização de sistemas de liberação de fármacos baseados em nanopartículas. Kauffman et ^al.5 consideraram estudos de otimização do LNP utilizando desenhos fatoriais fracionários e triagem definitiva⁶; no entanto, esses tipos de delineamentos não podem acomodar uma restrição de mistura sem recorrer ao uso de “variáveis folgadas” ^{ineficientes7} e não são tipicamente usados quando fatores de mistura estão presentes ^7,8. Em vez disso, “projetos ótimos” capazes de incorporar uma restrição de mistura são tradicionalmente usados para experimentos de processo de mistura⁹. Esses desenhos visam uma função especificada pelo usuário dos fatores de estudo e só são ótimos (em um dos vários sentidos possíveis) se essa função capturar a verdadeira relação entre os fatores de estudo e as respostas. Note-se que há uma distinção no texto entre “desenhos ótimos” e “candidatos a formulações ótimas”, sendo que este último se refere às melhores formulações identificadas por um modelo estatístico. Os projetos ideais vêm com três desvantagens principais para experimentos de processo de mistura. Primeiro, se o cientista não conseguir antecipar uma interação dos fatores de estudo ao especificar o modelo-alvo, então o modelo resultante será enviesado e poderá produzir formulações candidatas inferiores. Em segundo lugar, os projetos ideais colocam a maioria das corridas no limite externo do espaço do fator. Em estudos de LNP, isso pode levar a um grande número de corridas perdidas se as partículas não se formarem corretamente em quaisquer extremos das configurações lipídicas ou de processo. Em terceiro lugar, os cientistas geralmente preferem fazer ensaios experimentais no interior do espaço fatorial para obter uma noção independente do modelo da superfície de resposta e observar o processo diretamente em regiões anteriormente inexploradas do espaço fatorial.

Um princípio de projeto alternativo é visar uma cobertura uniforme aproximada do espaço do fator (com restrição de mistura) com um projeto de preenchimento de espaço¹⁰. Esses desenhos sacrificam alguma eficiência experimental em relação aos desenhos ótimos⁹ (assumindo que todo o espaço fatorial leva a formulações válidas), mas apresentam vários benefícios em um trade-off que são úteis nesta aplicação. O projeto de preenchimento de espaço não faz suposições a priori sobre a estrutura da superfície de resposta; Isso lhe dá a flexibilidade de capturar relações inesperadas entre os fatores do estudo. Isso também simplifica a geração de design porque não requer a tomada de decisões sobre quais termos de regressão adicionar ou remover à medida que o tamanho de execução desejado é ajustado. Quando alguns pontos de projeto (receitas) levam a formulações fracassadas, os projetos de preenchimento de espaço tornam possível modelar o limite de falha sobre os fatores de estudo, ao mesmo tempo em que apoiam modelos estatísticos para as respostas do estudo sobre as combinações de fatores bem-sucedidas. Finalmente, a cobertura interior do espaço do fator permite a exploração gráfica independente do modelo da superfície de resposta.

Para visualizar o subespaço do fator de mistura de um experimento de processo de mistura, são usadas “parcelas ternárias” triangulares especializadas. A Figura 1 motiva esse uso: no cubo de pontos onde três ingredientes podem variar de 0 a 1, os pontos que satisfazem uma restrição de que a soma dos ingredientes é igual a 1 são destacados em vermelho. A restrição de mistura nos três ingredientes reduz o espaço de fator viável a um triângulo. Em aplicações de LNP com quatro ingredientes de mistura, produzimos seis gráficos ternários diferentes para representar o espaço fatorial plotando dois lipídios de cada vez contra um eixo “Outros” que representa a soma dos outros lipídios.

Figura 1: Regiões do fator triangular. No gráfico de preenchimento de espaço dentro do cubo, os pequenos pontos cinzas representam formulações que são inconsistentes com a restrição de mistura. Os pontos vermelhos maiores encontram-se em um triângulo inscrito dentro do cubo e representam formulações para as quais a restrição de mistura é satisfeita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além dos fatores de mistura lipídica, muitas vezes há um ou mais fatores de processo contínuos, como relação N:P, concentração de tampão ou taxa de fluxo. Fatores categóricos podem estar presentes, como tipo de lipídio ionizável, tipo de lipídio auxiliar ou tipo de tampão. O objetivo é encontrar uma formulação (uma mistura de lipídios e ajustes para fatores de processo) que maximize alguma medida de potência e/ou melhore características físico-químicas, como minimizar o tamanho das partículas e o PDI (índice de polidispersidade), maximizar o encapsulamento percentual e minimizar efeitos colaterais – como perda de peso corporal – em estudos in vivo . Mesmo quando se parte de uma receita de referência razoável, pode haver interesse em reotimizar dada uma mudança na carga útil genética ou ao considerar mudanças nos fatores de processo ou tipos lipídicos.

Cornell⁷ fornece um texto definitivo sobre os aspectos estatísticos dos experimentos de mistura e processo de mistura, com Myers et ^al.9 fornecendo um excelente resumo dos tópicos mais relevantes de planejamento e análise de misturas para otimização. No entanto, esses trabalhos podem sobrecarregar os cientistas com detalhes estatísticos e com terminologia especializada. O software moderno para o projeto e análise de experimentos fornece uma solução robusta que suportará suficientemente a maioria dos problemas de otimização do LNP sem ter que apelar para a teoria relevante. Embora estudos mais complicados ou de alta prioridade ainda se beneficiem da colaboração com um estatístico e possam empregar projetos ótimos em vez de de preenchimento de espaço, nosso objetivo é melhorar o nível de conforto dos cientistas e incentivar a otimização de formulações LNP sem apelar para testes ineficientes de um fator de cada vez (OFAT)¹¹ ou simplesmente se contentar com a primeira formulação que satisfaça as especificações.

Neste artigo, é apresentado um fluxo de trabalho que utiliza software estatístico para otimizar um problema genérico de formulação de LNP, abordando problemas de projeto e análise na ordem em que serão encontrados. Na verdade, o método funcionará para problemas gerais de otimização e não se restringe aos LNPs. Ao longo do caminho, várias questões comuns que surgem são abordadas e recomendações são fornecidas que são fundamentadas na experiência e nos resultados da simulação¹². A estrutura recentemente desenvolvida de modelos de conjunto autovalidados (SVEM)¹³ melhorou muito a abordagem de outra forma frágil para analisar resultados de experimentos de processo de mistura, e usamos essa abordagem para fornecer uma estratégia simplificada para otimização de formulação. Enquanto o fluxo de trabalho é construído de uma maneira geral que poderia ser seguida usando outros pacotes de software, o JMP 17 Pro é único em oferecer SVEM juntamente com as ferramentas de resumo gráfico que achamos necessárias para simplificar a análise arcana de experimentos de processo de mistura. Como resultado, instruções específicas do JMP também são fornecidas no protocolo.

O SVEM emprega a mesma base de modelo de regressão linear que a abordagem tradicional, mas nos permite evitar modificações tediosas que são necessárias para ajustar um “modelo completo” de efeitos candidatos usando uma abordagem de base de seleção direta ou seleção penalizada (Lasso). Além disso, o SVEM fornece um ajuste aprimorado de “modelo reduzido” que minimiza o potencial de incorporação de ruído (processo mais variância analítica) que aparece nos dados. Ele funciona pela média dos modelos previstos resultantes da reponderação repetida da importância relativa de cada corrida no modelo 13,14,15,16,17,18. O SVEM fornece uma estrutura para modelar experimentos de processo de mistura que é mais fácil de implementar do que a regressão de tiro único tradicional e produz candidatos à formulação ótima de melhor qualidade^12,13. Os detalhes matemáticos do SVEM estão além do escopo deste artigo e mesmo um resumo superficial além da revisão da literatura relevante desviaria a atenção de sua principal vantagem nesta aplicação: ele permite um procedimento simples, robusto e preciso de clique para executar para os praticantes.

O fluxo de trabalho apresentado é consistente com a abordagem Quality by Design (QbD)¹⁹ para o desenvolvimento^{farmacêutico20}. O resultado do estudo será a compreensão da relação funcional que vincula os atributos do material e os parâmetros do processo aos atributos críticos da qualidade (CQAs)²¹. Daniel et ^al.22 discutem o uso de um framework QbD especificamente para a produção de plataformas de RNA: nosso fluxo de trabalho poderia ser usado como uma ferramenta dentro desse framework.