폐렴의 해결을 평가하기 위한 실험모델

이 연구에 설명된 모든 동물 프로토콜은 동물 프로토콜 MO21M160에 대해 존스 홉킨스 대학교 의과대학의 ACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인되었습니다. 또한, 실험은 동물 연구에 대한 기관, 주 및 연방 규정에 따라 수행되었습니다. 주의: 아래에 설명된 모든 프로토콜의 복제는 생물안전 캐비닛 아래의 모든 기관 BSL-2 지침에 따라 생물안전 레벨 2(BSL-2) 캐비닛에서 수행해야 합니다. 1. 상업적인 반복에서 세균성 주식을 도금하기 참고: 이 프로토콜은 공급자로부터 얻은 컬티 루프부터 시작하여 Spn (ATCC 49619) 및 Kpn (ATCC 43816)에 대한 박테리아 스톡을 성장시키는 데 사용할 수 있습니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 인큐베이터에서 37°C에서 15분 동안 5% 양혈 한천 플레이트를 데웁니다. 이를 위해 세포 인큐베이터를 사용할 수 있습니다. 후드 아래에서 박테리아 접종 루프에서 칼집을 제거하고 지그재그 패턴을 따라 한천 플레이트에 줄무늬를 그리며 조심스럽게 펼칩니다. 별도의 플레이트를 복제본으로 사용하여 이 단계를 반복합니다. 최대 5개의 플레이트에 동일한 루프로 줄무늬를 만들 수 있습니다. 최적의 박테리아 성장을 위해 37°C에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 3 일 동안 매일 박테리아를 통과시킵니다. 37 ° C에서 15 분 동안 혈액 한천 플레이트를 따뜻하게하고, 일회용 접종 루프를 사용하여 첫 번째 한천 플레이트에서 15-20 콜로니를 취한 다음 새롭고 미리 따뜻해진 한천 플레이트에 펴 바릅니다. 플레이트에 적절하게 라벨을 붙입니다. 2. 향후 사용을 위한 박테리아 성장 및 보관 3일 후 줄무늬 고리가 있는 혈액 한천 플레이트에서 최대 30개의 콜로니를 선택하고 Todd Hewitt 육수(TH 육수)가 들어 있는 250mL 플라스크에 직접 넣습니다. 37 ° C에서 250 rpm에서 흔들어 약 4 시간 동안 5 % CO2 로 배양합니다. OD620nm 가 0.3에 도달할 때까지 15분마다 부분 표본을 채취하여 측정하며, 이는 mL당 약 3 x 108 콜로니 형성 단위(CFU)에 해당합니다. 새로운 박테리아 스톡 1mL를 즉시 2mL 극저온 바이알에 분취합니다. 갓 분양된 바이알을 액체 질소에 5분 동안 급속 얼립니다. 박테리아의 부분 표본을 -80 °C 냉동고에 보관하십시오(바이알은 효능을 잃기 전에 최대 6-8개월 동안 사용할 수 있음). 7일 동안 얼린 후 부분 표본은 동물 연구에 사용할 수 있습니다. 따라서 박테리아의 새로운 농도를 결정하십시오. 3. 기관 내 점안을 위한 박테리아 해동 셰이커에서 37°C에서 10분 동안 혈액 한천 플레이트를 데웁니다. 냉동실에서 새 스톡 바이알 중 하나를 꺼내 37°C 수조에서 약 2분 동안 부드럽게 교반하여 해동합니다. 따뜻한 물로 O-링이나 캡을 만지지 마십시오. 박테리아 군체를 수동으로 계산하기 위해 혈액 한천 플레이트에 플레이트를 만듭니다. 1 x 10-6 희석을 수행하고 마지막 희석에서 200 μL를 예열된 혈액 한천 플레이트에 플레이트합니다. 이 작업을 중복으로 수행하십시오. 박테리아의 최적 성장을 위해 37 °C에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음 날, 다음 공식을 적용하여 새로운 박테리아 농도를 결정하십시오: CFU/mL = (콜로니 수 x 희석 계수) / 도금된 스톡의 부피 4. 살아있는 박테리아의 기관내 점안 참고: 이 프로토콜은 기관 내 50μL의 부피를 주입하도록 최적화되었습니다. 박테리아 스톡은 최대 6-9개월 동안 보관할 수 있습니다. 각 바이알에 박테리아 CFU가 있는지 확인하려면 각 실험 전에 플레이트하고 위에서 설명한 대로 박테리아 스톡 CFU를 계산한 다음 후속 희석을 위해 TH 육수를 사용해야 합니다. 주의: 생물 안전 캐비닛 아래에서 멸균 수술 기구를 사용하여 설치류 생존 절차를 수행하십시오. 케타민 100mg/kg과 아세틸프로마진 2.5mg/kg을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다. 한 번에 주입되는 마우스 수에 대해 반복합니다.알림: 생쥐는 동물 취급을 용이하게 하기 위해 이소플루란에 노출될 수 있습니다. 그러나, 심각한 동물의 고통을 일으키지 않고 복강 내 마취제를 주입할 수 있는 숙련된 핸들러는 이소플루란 노출을 피할 수 있습니다. 주입할 마우스의 수는 외과 의사의 전문 지식에 따라 다릅니다. 모든 쥐가 적절한 마취를 거친 후 꼬리 꼬집기로 마취를 확인합니다. 마취된 쥐를 깨끗하고 멸균된 표면에 놓고 앞니로 동물을 매달아 놓고 앞다리를 부드럽게 테이프로 붙입니다(그림 1A).참고: 동물의 건강을 보장하려면 마취된 모든 동물에게 각막 윤활제를 제공하십시오. 카르복시메틸셀룰로오스 점안액을 사용할 수 있으며, 눈당 한 방울을 바를 수 있습니다. 목 부위를 면도하고 클로르헥시딘과 70% 알코올로 해당 부위를 소독합니다. 수술용 가위를 사용하여 1cm의 표재성 정중선 목을 절개하여 기관을 시각화합니다(그림 1B). 한 번의 작은 절개로 충분하지만 지방 조직이 많이 보이면 지방 조직을 세로로 조심스럽게 절개하여 기관을 시각화합니다.알림: 팁 전용 기술을 통해 멸균 장갑과 멸균 기구를 사용하십시오. 시술이 멸균 상태에서 수행되는 경우 감염 위험이 최소화됩니다. 겸자를 사용하여 각 쥐를 삽관합니다. 혀를 바깥쪽으로 부드럽게 당기고 입을 통해 20G의 혈관 카테터를 도입하여 카테터를 기관 안으로 전진시킵니다. 삽관을 용이하게 하기 위해 기관에 부드러운 압력을 가합니다.참고: 기관이 쥐 몸체 앞쪽에 있기 때문에 카테터 끝을 약간 구부리면 마우스를 성공적으로 삽관할 수 있는 각도를 얻는 데 도움이 됩니다. 목 절개는 주로 시각화 목적으로 수행됩니다. 또는 작업자가 맹목적으로 기관을 삽관할 수 있습니다. 삽관 후 마우스를 인공호흡기에 연결하여 삽관을 확인합니다. 이 절차에 사용되는 일반 인공호흡기 매개변수는 200μL의 스트로크 부피와 분당 200스트로크입니다. 빠르고 쉽게 확인할 수 있도록 인공호흡기 속도를 잠시 높이거나 낮춥니다. 삽관을 확인한 후 인공호흡기에서 마우스를 분리하고 200μL 피펫 겔 로딩 팁을 사용하여 혈관 카테터를 통해 50μL의 세균 제제를 조심스럽게 주입합니다. 대조군 마우스의 경우 50μL의 멸균 TH 육수를 주입합니다. 세균성 병원체를 주입한 후 마우스를 호흡기에 다시 연결하여 호흡을 다시 시작하도록 돕습니다. 30-60초 동안 호흡보호구에 마우스를 올려 놓으십시오. 모든 쥐에게 주사한 후 호흡을 모니터링하십시오. 호흡 패턴이 느려지면 생쥐를 인공호흡기에 다시 연결합니다. 피부에 작은 접착제 한 방울을 떨어뜨려 절개 부위를 봉합합니다. 피부 주름을 모으고 접착제가 마를 때까지 부드러운 압력을 가합니다. 회복을 위해 쥐를 가열 패드에 놓고 충분한 의식을 회복할 때까지 면밀히 모니터링합니다. 완전히 회복되면 마우스를 케이지에 다시 넣으십시오. 수술 후 통증/고통 관리를 위해 마우스는 0.05-0.1mg/kg의 투여량으로 부프레노르핀으로 치료할 수 있습니다(SC).참고: 체중 감소가 20% 이상이거나 시술 후 무기력, 물이나 음식에 접근할 수 없음, 호흡 곤란, 외부 자극에 대한 반응 장애 또는 정신 각성 저하와 같은 심각한 고통을 겪는 동물은 안락사시켜야 합니다. 5. 기관지 폐포 세척 및 폐 적출 쥐를 5% 이소플루란이 들어있는 밀폐된 용기에 넣어 안락사시킵니다. 쥐가 호흡을 멈춘 후 1분 동안 이소플루란에 계속 노출시킵니다. 안락사를 확인하기 위해 개흉술을 시행합니다.참고: 육안 및 신체 검사로 안락사를 확정합니다. 심장 박동이 멈췄고 쥐가 숨을 쉬지 않았을 것입니다. 점막은 하얗거나 창백해야 합니다. 깨끗한 수술 보드에 마우스를 누운 자세로 놓고 앞니에 매달아 놓습니다. 쥐 피부에 70% 에탄올을 뿌립니다. 수술용 가위를 사용하여 쥐의 기관을 시각화하기 위해 작은 표재성 정중선 목 절개를 만듭니다. 20G 카테터로 기관을 캐뉼레이션합니다. 1mL 주사기를 사용하여 1mL의 무칼슘 인산염 완충 식염수(PBS)를 기관 내에 조심스럽게 추가합니다. 폐가 완전히 확장되도록 한 다음 동일한 주사기를 사용하여 액체를 흡인합니다. 총 2mL에 대해 이 단계를 반복합니다. BAL을 2mL 부분 표본으로 옮깁니다. 최종 부피 2mL에 대해 이 단계를 두 번 수행합니다. 폐포 공간 붕괴의 위험이 높으므로 한 번에 1mL 이상으로 폐를 세척하지 마십시오. 흉강을 열고 가위와 집게를 사용하여 폐, 심장, 기관을 노출시킵니다. 횡격막을 조심스럽게 절개하고 흉곽을 제거합니다. 폐 조직이 끼지 않도록 주의하십시오. 복부 대동맥을 경절하여 출혈을 허용합니다. 가위를 사용하여 우심실을 약 2mm의 작은 절개로 폐 조직을 관류하고 20G 카테터를 사용하여 5mL의 차가운 PBS를 주입합니다. PBS는 폐에 관류해야 합니다. 적절한 관류가 수행되면 폐 조직이 하얗게 창백해지고 PBS는 복부 대동맥을 통해 혈관 내 구획을 떠납니다. 조심스럽게 폐를 추출하고 기관에서 절개하여 조직학 또는 단세포 현탁액에 대한 추가 처리를 수행합니다. 조직학을 위해 처리하는 경우 20G 카테터를 조심스럽게 삽입하여 포르말린 용액(중성 완충 10%)으로 폐를 최대 25cm H2O까지 팽창시킵니다. 폐가 막히면 기관 아래에 약 5cm 길이의 3.0 봉합 줄을 통과시키고 포르말린이 폐 조직에 머물도록 두 번 단단히 묶습니다. 나머지 조직에서 폐를 부드럽게 절개하고 10mL의 포르말린 용액이 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 6. 기관지폐포 세척 처리 BAL을 4°C에서 500 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다. 별도의 튜브에서 cell-free 상층액을 제거하고 -80 °C에서 보관합니다.참고: 단백질 정량화(예: BCA 분석13) 또는 특정 바이오마커 또는 사이토카인 측정(ELISA 분석 및 MSD 및 Luminex와 같은 플랫폼을 사용한 다중 분석)을 포함하여 BAL 상층액에서 추가 분석을 수행할 수 있습니다. 1분 동안 100μL의 용해 완충액을 추가하여 적혈구를 용해합니다. PBS 1mL를 첨가하여 용해 반응을 중화합니다. BAL을 4°C에서 500 x g 으로 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. PBS(100-300 μL, 세포 펠릿 크기 기준)에 세포를 재현탁시킵니다. 수동 또는 자동 세포 계수를 통해 0.4% 트리판 블루 염색으로 세포 계수를 수행합니다. 추가 테스트를 위해 유세포 분석 염색 및/또는 액체 질소에 동결 보존(동결 보존 용액에 재현탁)을 위해 나머지 펠릿을 사용하십시오. 7. 단세포 현탁액을 위한 폐 가공 나머지 조직에서 폐를 부드럽게 절개하고 5mL의 차가운 PBS가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. PBS에서 폐를 제거하고 종이 타월을 사용하여 말리십시오. DNase 1mg과 콜라겐 분해 효소 5mg을 저포도당 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) 1mL에 첨가하여 소화 칵테일을 준비합니다. 폐를 1mL의 분해 칵테일이 들어 있는 C-튜브로 옮깁니다. C-튜브를 조직 해리기로 옮기고 폐 조직 처리를 위한 표준화된 프로토콜을 따릅니다14. 10mL의 콜드 PBS를 C-튜브에 넣고 적절하게 혼합합니다. 50mL 코니컬 튜브 위에 70μm 셀 스트레이너를 사용하여 단일 셀 현탁액을 여과합니다. 필터링을 두 번 수행합니다. 현탁액을 4°C에서 500 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 디캔팅하고 실온에서 1분 동안 용해 완충액 1mL를 추가합니다. 10mL의 차가운 PBS를 추가하여 용해 반응을 중지하고 상층액을 제거합니다. 현탁액을 4°C에서 500 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 디캔팅하고 10mL의 콜드 PBS를 추가합니다. 수동 또는 자동 세포 계수를 통해 trypan blue 염색으로 세포 계수를 수행합니다. 유세포 분석 염색을 위해 세포 펠릿을 사용하거나 추가 테스트를 위해 액체 질소에서 동결 보존합니다.