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免疫学と感染

Modèle expérimental pour évaluer la résolution de la pneumonie

Published: February 17, 2023
doi:
10.3791/63925
, ,
1Division of Pulmonary Critical Care Medicine,Johns Hopkins University School of Medicine, 2Engineering Management, Whiting School of Engineering,Johns Hopkins University

概要

Ce manuscrit décrit l’établissement d’un modèle infectieux de pneumonie chez la souris et la caractérisation respective de la résolution des lésions ainsi que les méthodes de croissance bactérienne et d’instillation intratrachéale. Une nouvelle approche utilisant la cytométrie en flux de grande dimension pour évaluer le paysage immunitaire est également décrite.

Abstract

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) provoque des lésions pulmonaires aiguës, caractérisées par des lésions alvéolaires rapides et une hypoxémie sévère. Cela entraîne à son tour une morbidité et une mortalité élevées. À l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle préclinique qui récapitule la complexité du SDRA humain. Cependant, les modèles infectieux de pneumonie (PNA) peuvent reproduire les principales caractéristiques physiopathologiques du SDRA. Ici, nous décrivons un modèle de PNA induit par l’instillation intratrachéale de Streptococcus pneumoniae et Klebsiella pneumoniae vivants chez des souris C57BL6. Afin d’évaluer et de caractériser le modèle, après avoir induit une lésion, nous avons effectué des mesures en série du poids corporel et du lavage broncho-alvéolaire (BAL) pour mesurer les marqueurs de lésion pulmonaire. De plus, nous avons récolté des poumons pour le comptage cellulaire et les différentiels, la quantification de la protéine BAL, le cytospin, le nombre d’unités formant des colonies bactériennes et l’histologie. Enfin, une cytométrie à haut débit dimensionnel a été réalisée. Nous proposons ce modèle comme outil pour comprendre le paysage immunitaire pendant les phases de résolution précoce et tardive des lésions pulmonaires.

Introduction

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) reste un syndrome létal et invalidant courant qui touche environ 10 % des patients en unité de soins intensifs (USI) et jusqu’à 23 % des personnes sous ventilation mécanique, entraînant un taux de mortalité hospitalière de 35 % à 46 %1. De plus, la récente pandémie de COVID-19 a souligné à nouveau l’importance d’étudier le SDRA. Les cas positifs à la COVID-19 ont entraîné une augmentation de la mortalité due au SDRA, ce qui souligne les limites des traitementspharmacologiques2.

Chez l’homme, le SDRA se caractérise par l’apparition rapide d’une hypoxémie (PaO2/FiO2 < 300) et la mise en évidence d’un œdème pulmonaire bilatéral non hydrostatique dû à une perméabilité alvéolaire-capillaire excessive et à une alvéolite3. Bien que le SDRA ait été traditionnellement décrit comme un schéma de lésions pulmonaires aiguës (ALI) secondaires à une variété d’agressions, la pneumonie bactérienne et virale (PNA) reste parmi les causes les plus courantes. Trois stades physiopathologiques principaux, à savoir les stades exsudatif, prolifératif et fibrotique, ont été décrits, tandis que les deux principales caractéristiques cardinales du SDRA sont une inflammation dérégulée et une perturbation alvéolocapillaire4. Au cours de ces processus, des lésions alvéolaires sont produites par la libération de cytokines inflammatoires (par exemple, le facteur de nécrose tumorale [TNF-α], l’interleukine [IL-1β, IL-6, IL-8, etc.]), un afflux de neutrophiles et de macrophages inflammatoires, et l’inondation de liquide riche en protéines. En fin de compte, ces événements entraînent des lésions alvéolaires inégales et bilatérales 5,6,7,8.

Bien que des progrès significatifs aient été réalisés dans la compréhension des lésions pulmonaires et de l’inflammation précoces, les mécanismes sous-jacents à la résolution de l’ANP sont moins connus et devraient faire l’objet de futures recherches mécanistes. L’objectif principal de cet article est de fournir aux chercheurs un modèle de résolution des lésions de la pneumonie infectieuse capable de reproduire les principales caractéristiques physiopathologiques du SDRA. Nous proposons que ce modèle aide à mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à la résolution de l’inflammation et à la réparation pulmonaires, servant ainsi de plate-forme pour des thérapies de sauvetage.

Les principaux stades physiopathologiques survenant au cours du SDRA peuvent être reproduits dans des modèles animaux précliniques d’ALA, qui doivent inclure une preuve histologique de réponse inflammatoire, de lésion tissulaire, de dysfonctionnement physiologique, d’alvéolite et d’altération de la barrière alvéolaire-capillaire9. Un modèle murin qui induit l’ANP et l’ALI est avantageux en raison de sa reproductibilité élevée, de sa reproduction rapide et de la disponibilité de plusieurs outils pour effectuer des études mécanistes et moléculaires. Il n’existe pas de modèle unique qui récapitule entièrement toutes les caractéristiques de l’ARDS9 humain.

Les modèles de PNA chez la souris permettent la réplication des principaux mécanismes physiopathologiques produits par le SDRA-infectieux chez l’homme, tels que l’apparition rapide, la preuve de lésions tissulaires en histologie, l’altération de la barrière alvéolo-capillaire, la preuve de réponse inflammatoire et le dysfonctionnement physiologique tout en produisant une mortalité modeste10 . Les modèles infectieux peuvent être induits par l’administration locale ou systémique de l’agent pathogène, l’administration intranasale, intratrachéale et intraveineuse étant les voies d’administration les plus fréquentes. La voie intratrachéale permet l’inoculation directe de l’agent infectieux dans les poumons, diminuant l’aérosolisation et optimisant l’administration11,12.

La méthodologie d’un modèle murin préclinique de PNA par instillation intratrachéale de Streptococcus pneumoniae (Spn) ou de Klebsiella pneumoniae (Kp) vivante est décrite ici. Ces modèles représentent un bon substitut du SDRA produit par l’ANP bactérien, possédant plusieurs avantages, notamment : les causes prévalentes du SDRA-PNA humain (acquis dans la communauté et à l’hôpital) ; haute reproductibilité ; la mortalité et les lésions peuvent être facilement ajustées (modélisation de différents degrés d’inflammation pulmonaire) pour présenter une réponse inflammatoire robuste, conduisant à une alvéolite et à un dysfonctionnement alvéolocapillaire ; l’évaluation des phases précoces et tardives des lésions pulmonaires et de leur résolution ; et l’évaluation de stratégies thérapeutiques à différents stades du SNRA-PNA.

Protocol

Tous les protocoles sur les animaux décrits dans cette étude ont été approuvés par l’Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) de la faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins pour le protocole sur les animaux MO21M160. De plus, les expériences ont été réalisées conformément aux réglementations institutionnelles, étatiques et fédérales pour la recherche sur les animaux. ATTENTION : La reproduction de tous les protocoles décrits ci-dessous doit être effectuée dans une enceinte de niveau de biosécurité 2 (BSL-2), conformément à toutes les directives institutionnelles BSL-2 sous l’enceinte de biosécurité. 1. Placage de stocks bactériens à partir de boucles commerciales REMARQUE : Ce protocole peut être utilisé pour la culture de souches bactériennes pour Spn (ATCC 49619) et Kpn (ATCC 43816), en commençant par les boucles de culture obtenues auprès du fournisseur (voir la table des matériaux pour plus de détails). Réchauffer une plaque de gélose au sang de mouton à 5 % pendant 15 min à 37 °C dans un incubateur. Un incubateur cellulaire peut être utilisé à cet effet. Sous le capot, retirez la gaine de la boucle d’inoculation bactérienne et étalez-la soigneusement, en striant dans la plaque de gélose, en suivant un motif en zigzag. Répétez cette étape en utilisant une plaque séparée en double. Jusqu’à cinq plaques peuvent être stries avec la même boucle. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C pour une croissance optimale des bactéries. Passage des bactéries quotidiennement pendant 3 jours. Réchauffez les plaques de gélose au sang pendant 15 minutes à 37 °C, prélevez entre 15 et 20 colonies de la première plaque de gélose à l’aide d’une boucle d’inoculation jetable et étalez-les dans une nouvelle plaque de gélose préchauffée. Étiquetez la plaque de manière appropriée. 2. Croissance et stockage des bactéries pour une utilisation future Après 3 jours, prélevez jusqu’à 30 colonies de la plaque de gélose au sang à l’aide d’une boucle de stries et placez-les directement dans une fiole de 250 ml contenant du bouillon Todd Hewitt (bouillon TH). Incuber à 37 °C, en secouant à 250 tr/min, avec 5% de CO2 pendant environ 4 h. Prélever des aliquotes toutes les 15 minutes pour mesurer la DOde 620 nm jusqu’à ce qu’elle atteigne 0,3, ce qui équivaut à environ 3 x 108 unités formant colonies (UFC) par ml. Classez immédiatement 1 ml de la nouvelle bactérie dans des flacons cryogéniques de 2 ml. Congelez les flacons fraîchement aliquotes dans de l’azote liquide pendant 5 min. Conservez les aliquotes de bactéries dans un congélateur à -80 °C (les flacons peuvent être utilisés jusqu’à 6 à 8 mois avant de perdre de leur efficacité). Après 7 jours de congélation, les aliquotes peuvent être utilisées pour des études sur les animaux. Par conséquent, déterminez la nouvelle concentration de la bactérie. 3. Décongélation des bactéries pour l’instillation intratrachéale Réchauffer une plaque de gélose au sang pendant 10 min à 37 °C dans un agitateur. Sortez l’un des nouveaux flacons de stock du congélateur et décongelez-le en l’agitant doucement dans un bain-marie à 37 °C pendant environ 2 min. Évitez de toucher le joint torique ou le capuchon avec de l’eau tiède. Plaque sur une plaque de gélose au sang pour compter manuellement les colonies bactériennes. Effectuer une dilution 1 x 10-6 et déposer 200 μL de la dernière dilution dans une plaque de gélose au sang préchauffée. Faites-le en double. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C pour une croissance optimale des bactéries. Le lendemain, appliquez la formule suivante pour déterminer la nouvelle concentration bactérienne : UFC/mL = (nombre de colonies x facteur de dilution) / volume de bouillon plaqué 4. Instillation intratrachéale de bactéries vivantes REMARQUE : Ce protocole a été optimisé pour instiller un volume de 50 μL par voie intratrachéale. Les stocks bactériens peuvent être conservés jusqu’à 6 à 9 mois. Pour vous assurer de la présence d’UFC bactérienne dans chaque flacon, assurez-vous de la mettre en plaques avant chaque expérience, de calculer l’UFC de stock bactérien comme décrit ci-dessus et d’utiliser du bouillon TH pour les dilutions ultérieures. ATTENTION : Sous l’enceinte de biosécurité, effectuez une procédure de survie des rongeurs à l’aide d’instruments chirurgicaux stériles. Anesthésier la souris en injectant par voie intrapéritonéale 100 mg/kg de kétamine et 2,5 mg/kg d’acétylpromazine. Répétez l’opération pour le nombre de souris injectées à la fois.REMARQUE : Les souris peuvent être exposées à l’isoflurane pour faciliter la manipulation des animaux. Cependant, un manipulateur expérimenté capable d’injecter des anesthésiques intrapéritonéaux sans causer de détresse importante à l’animal peut éviter l’exposition à l’isoflurane. Le nombre de souris à injecter dépend de l’expertise du chirurgien. Une fois que toutes les souris sont sous anesthésie appropriée, confirmez l’anesthésie par pincement de la queue. Placez la souris anesthésiée sur une surface propre et stérilisée, suspendez l’animal par les incisives et collez doucement les membres antérieurs avec du ruban adhésif (Figure 1A).REMARQUE : Pour assurer le bien-être des animaux, assurez la lubrification de la cornée chez tous les animaux anesthésiés. Des gouttes ophtalmiques à base de carboxyméthylcellulose peuvent être utilisées, à raison d’une goutte par œil. Rasez la région du cou et désinfectez la zone avec de la chlorhexidine et de l’alcool à 70%. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision superficielle de 1 cm au milieu du cou pour visualiser la trachée (Figure 1B). Une petite incision devrait suffire, mais si une abondance de tissu adipeux est observée, disséquez soigneusement le tissu adipeux verticalement pour visualiser la trachée.REMARQUE : Utilisez des gants stériles et des instruments stériles via la technique des pointes uniquement. Le risque d’infection est minime si l’intervention est réalisée dans des conditions stériles. À l’aide d’une pince, intubez chaque souris. Tirez doucement la langue vers l’extérieur et introduisez un angio-cathéter de 20 G dans la bouche, en faisant avancer le cathéter dans la trachée. Appliquez une légère pression sur la trachée pour faciliter l’intubation.REMARQUE : Parce que la trachée est antérieure au corps de la souris, pliez légèrement l’extrémité du cathéter, car cela aidera à obtenir l’angle pour intuber avec succès la souris. L’incision du cou est réalisée principalement à des fins de visualisation ; Alternativement, l’opérateur peut intuber la trachée à l’aveugle. Après l’intubation, connectez la souris à un respirateur pour confirmer l’intubation. Les paramètres habituels du ventilateur utilisés dans cette procédure sont de 200 μL de volume de course et de 200 coups par minute. Augmentez et/ou diminuez brièvement le débit du ventilateur pour une confirmation rapide et facile. Après avoir confirmé l’intubation, débranchez la souris du respirateur et instillez soigneusement 50 μL de l’agent bactérien à travers l’angio-cathéter à l’aide d’un embout de chargement de gel de pipette de 200 μL. Pour les souris témoins, injecter 50 μL de bouillon TH stérile. Après avoir instillé l’agent bactérien, connectez à nouveau la souris au respirateur pour aider à redémarrer la respiration. Laissez la souris sur le respirateur pendant 30 à 60 s. Après avoir injecté toutes les souris, surveillez leur respiration. S’il y a une respiration lente, connectez à nouveau les souris au respirateur. Fermez l’incision en ajoutant une petite goutte de colle sur la peau. Rassemblez les plis de la peau et appliquez une légère pression jusqu’à ce que la colle sèche. Placez les souris sur un coussin chauffant pour la récupération et surveillez-les de près jusqu’à ce qu’elles retrouvent une conscience suffisante. Transférez les souris dans la cage une fois complètement rétablies. Pour la gestion de la douleur et de la détresse postopératoires, les souris peuvent être traitées avec de la buprénorphine, à une dose de 0,05 à 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée (SC).REMARQUE : Les animaux ayant une perte de poids supérieure à 20% ou éprouvant une détresse importante après l’intervention, comme une léthargie, une incapacité à atteindre l’eau ou la nourriture, une respiration laborieuse, une réponse altérée aux stimuli externes ou une diminution de la vigilance mentale, doivent être euthanasiés. 5. Lavage broncho-alvéolaire et prélèvement pulmonaire Euthanasiez la souris en la plaçant dans un récipient fermé contenant 5% d’isoflurane. Continuez l’exposition à l’isoflurane pendant 1 minute après que la souris a cessé de respirer. Effectuer une thoracotomie pour confirmer l’euthanasie.REMARQUE : Confirmer l’euthanasie par un examen visuel et physique. Le cœur a dû cesser de battre et les souris ne pas respirer. Les muqueuses doivent être blanches ou pâles. Posez la souris en position couchée sur une planche chirurgicale propre et suspendez-la par les incisives. Vaporisez la peau de la souris avec de l’éthanol à 70%. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une petite incision superficielle au milieu du cou pour visualiser la trachée de la souris. Canuler la trachée à l’aide d’un cathéter de 20 G. Avec précaution, ajoutez 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium par voie intratrachéale, à l’aide d’une seringue de 1 ml. Laissez l’expansion pulmonaire complète, puis aspirez le liquide à l’aide de la même seringue. Répétez cette étape pour un total de 2 ml. Transférer le BAL dans une aliquote de 2 ml. Effectuez cette étape deux fois pour un volume final de 2 ml. Ne lavez pas les poumons avec plus de 1 ml à la fois, en raison du risque élevé de perturbation de l’espace alvéolaire. Ouvrez la cavité thoracique et exposez le poumon, le cœur et la trachée à l’aide de ciseaux et de pinces. Disséquez soigneusement le diaphragme et retirez la cage thoracique. Assurez-vous de ne pas pincer le tissu pulmonaire. Transect de l’aorte abdominale pour permettre l’exsanguination. Perfuser le tissu pulmonaire en faisant une petite incision d’environ 2 mm dans le ventricule droit à l’aide de ciseaux et injecter 5 mL de PBS froid à l’aide d’un cathéter de 20 G. Le PBS doit perfuser le poumon. Si une perfusion adéquate est effectuée, le tissu pulmonaire deviendra blanc pâle et le PBS quittera le compartiment intravasculaire par l’aorte abdominale. Soigneusement, extrayez les poumons et disséquez-les de la trachée pour effectuer une histologie ou un traitement ultérieur en suspension unicellulaire. En cas d’histologie, insérez soigneusement un cathéter de 20 G pour gonfler les poumons jusqu’à 25 cm H2O avec une solution de formol (tampon neutre 10 %). Une fois les poumons insufflés, passez un cordon de suture 3.0 d’environ 5 cm de long sous la trachée et attachez-le fermement deux fois pour vous assurer que le formol reste dans le tissu pulmonaire. Disséquez doucement le poumon du reste des tissus et placez-le dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de solution de formol. 6. Traitement du lavage broncho-alvéolaire Centrifuger le BAL à 500 x g à 4 °C pendant 5 min. Retirez le surnageant acellulaire dans un tube séparé et conservez-le à -80 °C.REMARQUE : D’autres analyses peuvent être effectuées dans le surnageant BAL, y compris la quantification des protéines (par exemple, le testBCA 13) ou la mesure de biomarqueurs ou de cytokines spécifiques (tests ELISA et tests multiples avec des plateformes telles que MSD et Luminex). Lyser les globules rouges en ajoutant 100 μL de tampon de lyse pendant 1 min. Neutralisez la réaction de lyse en ajoutant 1 mL de PBS. Centrifuger le BAL à 500 x g à 4 °C pendant 5 min et retirer le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans du PBS (100-300 μL ; en fonction de la taille des pastilles de cellule). Effectuez une numération cellulaire avec une coloration au bleu de trypan à 0,4 % par comptage manuel ou automatisé des cellules. Utilisez la pastille restante pour la coloration par cytométrie en flux et/ou la cryoconservation (en la remettant en suspension dans une solution de cryoconservation) dans l’azote liquide pour des tests supplémentaires. 7. Traitement pulmonaire pour suspension unicellulaire Disséquez doucement le poumon du reste des tissus et placez-le dans un tube conique de 15 ml contenant 5 ml de PBS froid. Retirez le poumon du PBS et séchez-le à l’aide d’une serviette en papier. Préparez un cocktail de digestion en ajoutant 1 mg de DNase et 5 mg de collagénase dans 1 mL de milieu modifié Eagle’s de Dulbecco à faible teneur en glucose (DMEM). Transférez le poumon dans un tube C contenant 1 mL de cocktail de digestion. Transférez le tube C dans le dissociateur tissulaire et suivez le protocole standardisé pour le traitement du tissu pulmonaire14. Ajouter 10 ml de PBS froid dans le tube C et bien mélanger. Filtrer la suspension à cellule unique à l’aide d’une crépine à cellules de 70 μm sur un tube conique de 50 mL. Effectuez la filtration deux fois. Centrifuger la suspension à 500 x g à 4 °C pendant 5 min. Décanter soigneusement le surnageant et ajouter 1 mL de tampon de lyse pendant 1 min à température ambiante. Ajouter 10 mL de PBS froid pour arrêter la réaction de lyse et éliminer le surnageant. Centrifuger la suspension à 500 x g à 4 °C pendant 5 min. Décanter soigneusement le surnageant et ajouter 10 mL de PBS froid. Effectuez un comptage cellulaire avec la coloration au bleu trypan par comptage manuel ou automatisé des cellules. Utilisez une pastille cellulaire pour la coloration par cytométrie en flux et/ou la cryoconservation dans l’azote liquide pour des tests supplémentaires.

Representative Results

Les procédures décrites ci-dessus ont permis de modéliser les mécanismes physiopathologiques sous-jacents aux lésions pulmonaires induites par la pneumonie bactérienne chez la souris. Pour commencer la modélisation, des souris de type sauvage (WT) C57BL/6 ont été obtenues du Jackson Laboratory et élevées dans l’animalerie de l’institut. Des souris mâles WT C57BL/6, âgées de 8 semaines, ont subi une inoculation intratrachéale soit d’un bouillon de TH (témoin), soit de 3 x 106 UFC de Spn vivant, soit de 200 UFC de Kpn vivant. Après l’infection, les souris ont été surveillées pendant 6 et 10 jours pour Spn et Kpn, respectivement. Bien que les groupes infectés aient montré un poids corporel inférieur à celui du témoin non infecté, le groupe Spn a récupéré son poids corporel vers le départ, tandis que les souris infectées par Kpn ont montré une récupération lente après 6 jours d’infection (Figure 2A). Pendant la durée de l’étude, aucune souris n’a dû subir d’euthanasie en raison d’un poids corporel supérieur à 20 %, et il n’y avait aucun signe de douleur et de détresse. Nous avons mesuré les lésions pulmonaires à différents intervalles. La concentration en protéines BAL et le nombre total de cellules pour le BAL et les poumons étaient nettement plus élevés dans les groupes infectés (figure 2). Des coupes histologiques représentatives montrant le processus inflammatoire dans les deux modèles ont été obtenues aux jours 2, 4 et 6 après l’inoculation (Figure 3), montrant des signes d’inflammation alvéolaire persistante chez les souris infectées par Kpn (Figure 4), même au jour 10. Les souris infectées par le Kpn ont continué à causer la lésion au 10e jour (figure 2 et figure 4), tandis que les souris infectées par le Spn ont résolu l’inflammation pulmonaire au 6e jour (figure 2 et figure 3). Des suspensions de cellules uniques pulmonaires ont été utilisées pour discriminer le paysage immunitaire par cytométrie en flux de haute dimension au jour 6 après l’infection dans le modèle Spn , en utilisant un panel de 18 couleurs en tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). En utilisant l’intégration stochastique voisine distribuée t (t-SNE), des différences globales dans la composition des cellules immunitaires peuvent être visualisées, étant remarquables pour un nombre accru de granulocytes (CD45+, CD11b+, CD24+, MHC-II-), de macrophages interstitiels (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-), de monocytes (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-, CD64-), de cellules B (CD45+, CD19+) et de cellules T (CD45+, CD3+), y compris les cellules tueuses naturelles (CD45+, CD3+, NK1.1+), comme le montre la figure 5. Les stratégies de contrôle sont illustrées à la figure 6. Figure 1 : Intervention chirurgicale pour l’instillation intratrachéale de bactéries vivantes. (A) Position de la souris dans la zone chirurgicale stérile, suspendue par les incisives. (B) Zone d’incision et exposition de la trachée. (C) Processus d’intubation : insertion du cathéter de 20 G. Figurine créée avec Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Profils des lésions pulmonaires aiguës (LAI) après modèles de pneumonie. (A) Poids corporel au fil du temps par rapport à la ligne de base, témoin par rapport à Kpn et Spn (n = 4, par groupe). (B) Quantification de la protéine totale BAL par dosage BCA (n = 4, par groupe). (C) Nombre total de cellules BAL chez le témoin (n = 3), Kpn (n = 4) et Spn (n = 3). (D) Nombre total de cellules pulmonaires chez le témoin (n = 3), Kpn (n = 4) et Spn (n = 3). (E-G) Différentiel de cellules BAL par numération histologique manuelle du cytospin BAL chez le contrôle (n = 3), Kpn (n = 4) et Spn (n = 3). Des tests statistiques ont été effectués par test t individuel, comparant le témoin non infecté aux groupes infectés. *p < 0,05. Les données sont affichées à l’aide de l’erreur type (ET) pour chaque graphique. L’axe des y correspond au nombre de jours post-infection pour tous les panels. Abréviations : BAL = lavage broncho-alvéolaire ; Spn = Streptococcus pneumoniae ; Kpn = Klebsiella pneumoniae. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Résultats histopathologiques pulmonaires pendant l’infection par Spn. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) des coupes histologiques d’un BAL représentatif et d’une coupe pulmonaire après l’infection intratrachéale de Spn et aux jours 2, 4 et 6. Grossissement BAL = 100x ; grossissement pulmonaire = 10x. Abréviations : BAL = lavage broncho-alvéolaire ; Spn = Streptococcus pneumoniae. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Résultats histopathologiques pulmonaires pendant l’infection par Kpn. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) des coupes histologiques d’un BAL représentatif et d’une coupe pulmonaire après l’infection intratrachéale de Kpn aux jours 2, 4, 6 et 10. Les images montrent un grossissement puissant (barre d’échelle = 50 μm). Abréviations : BAL = lavage broncho-alvéolaire ; Kpn = Klebsiella pneumoniae. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Paysage cellulaire immunitaire par cytométrie en flux multicolore après 6 jours d’infection par Spn. (A) L’intégration stochastique voisine distribuée en T (t-SNE) a été utilisée pour visualiser les populations de cellules immunitaires (CD45+) du poumon en comparant le groupe témoin non infecté au groupe infecté. (B) Résumé des fréquences des cellules immunitaires à partir du total des cellules CD45+ dans les poumons. (C) Nombre total de cellules de chaque population individuelle. Des comparaisons statistiques ont été effectuées par tests t entre le témoin et l’infecté. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Les données sont affichées à l’aide de l’erreur type (ET) pour chaque graphique. Abréviations : BAL = lavage broncho-alvéolaire ; Spn = Streptococcus pneumoniae. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Stratégies de contrôle pour identifier la sous-population de cellules immunitaires dans les poumons au départ et après une pneumonie. BAL et la suspension de cellules pulmonaires ont subi une coloration pour la cytométrie en flux multicolore. Les débris ont d’abord été bloqués à l’aide de SSC-A et de FSC-A, et les cellules individuelles ont été fermées par deux stratégies (SSC-W vs SSC-H et FSC-W vs FSC-H). Les cellules vivantes ont été identifiées à l’aide d’un discriminateur vivant/mort par rapport au SSC-A. Les populations cellulaires subséquentes ont été identifiées à l’aide de marqueurs 15. Abréviation : BAL = lavage broncho-alvéolaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Des modèles murins expérimentaux de PNA offrent une plate-forme pour évaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents aux lésions et à la résolution du SDRA. Les composantes physiopathologiques qui peuvent être évaluées comprennent les voies inflammatoires précoces, la clairance bactérienne, les changements dynamiques du paysage immunitaire, la résolution de l’inflammation, la fibroprolifération et la réparation épithéliale et vasculaire16. Cependant, plusieurs aspects doivent être pris en compte lors de la planification de la reproduction de ce modèle de lésions pulmonaires induites par la pneumonie, notamment l’âge, le sexe, la souche de souris, les facteurs intrinsèques de l’hôte (p. ex., l’état immunodéprimé), l’agent pathogène spécifique et la charge bactérienne utilisés, et l’expérience du personnel qui effectue l’intervention.

L’ANP est l’une des principales causes de SDRA. Nous avons choisi d’utiliser des Spn et des Kpn vivants, qui sont des causes prévalentes d’ANP acquises dans la communauté et à l’hôpital chez l’homme, respectivement17. Nous suggérons d’optimiser les modèles bactériens de PNA en titrant les doses de bactéries vivantes pour obtenir le profil de résolution de mortalité et de blessure souhaité qui correspond le mieux à l’hypothèse de l’investigateur. Nous avons optimisé une inoculation intratrachéale de bactéries de 3 x 106 UFC pour Spn et 200 UFC pour Kpn chez la souris, ce qui a provoqué une inflammation alvéolaire, une perturbation de la barrière alvéolocapillaire et un dysfonctionnement des organes (Figure 2). Cependant, des lots bactériens provenant de différentes sources ou même à l’intérieur de boucles dupliquées peuvent présenter différents degrés d’inflammation et de blessures, même lors de l’utilisation de la même souche et de la même UFC.

Par conséquent, pour reproduire les résultats présentés dans ce manuscrit, les chercheurs doivent commencer par la concentration de bactéries décrite ici ; Cependant, ils peuvent avoir besoin d’augmenter ou de diminuer la dose pour obtenir un profil de modèle similaire. Par conséquent, chaque nouveau lot de bactéries utilisé doit être optimisé pour son effet potentiel de résolution des blessures. Nous présentons un modèle robuste de PNA avec deux résultats de résolution différents, l’un auto-résolutif (Spn) et l’autre lentement/non résolu (Kpn) qui peut servir de plate-forme aux chercheurs pour évaluer les mécanismes immunologiques et tester des interventions thérapeutiques, en particulier au pic ou après l’infection (par exemple, 2 jours après l’infection).

L’âge, le sexe, la tension et les facteurs génétiques ont un impact sur la cinétique des modèles de résolution des blessures16. Par exemple, le sexe accélère la résolution chez les femelles par rapport aux mâles18 ; Par conséquent, une augmentation de la charge bactérienne entraîne une augmentation de la mortalité et une résolution retardée chez les mâles par rapport aux femelles. Le vieillissement est un autre facteur à prendre en compte lors du titrage de l’UFC des bactéries utilisées. Les souris vieillissantes présentaient une mortalité de 100 % lorsque nous avons utilisé la dose spécifiée de Spn (non indiquée ici). Les jeunes souris sont le plus souvent utilisées dans les modèles d’ANP pneumococcique (allant de 6 à 14 semaines), tandis que les souris âgées (âgées de 19 à 26 mois) présentent une réponse immunitaire altérée et sont utilisées pour étudier le rôle du vieillissement dans l’ANP11. Nous avons dû réduire l’UFC à 300 % pour atteindre la survie des animaux vieillissants (non illustré ici). Des souris mâles C57BL/6 (âgées de 8 à 12 semaines) ont été utilisées dans cette étude et ont été suivies pendant 6 à 10 jours après l’infection. Des différences significatives de sensibilité peuvent également être observées entre les souches ; les souches consanguines telles que BALB/C et C57BL6/J ont des réponses différentes à l’infection11,19.

L’inoculation directe des bactéries par voie intratrachéale permet une administration plus précise de l’inoculum (jusqu’à 99 %) dans les poumons12, ce qui représente une alternative pour les sérotypes moins virulents et diminue l’aérosolisation des bactéries11. Cependant, on peut faire valoir qu’il s’agit d’une procédure invasive. L’intubation peut être difficile, nécessite une anesthésie systémique et peut entraîner un traumatisme trachéal avec œdème des voies respiratoires et stridor. Les souris peuvent développer un réflexe vasovagal qui conduit à l’apnée, pour laquelle il est nécessaire d’avoir un petit ventilateur de souris pour fournir un soutien respiratoire supplémentaire en cas de besoin. L’expertise du chirurgien qui effectue l’intervention est un élément essentiel pour garantir la réussite de l’intubation11. Dans notre étude, aucune souris n’a eu besoin d’être euthanasiée en raison d’une gestion appropriée de la douleur et d’une perte de poids corporelle ne dépassant pas 20 %. Aucun signe de douleur et de détresse tel qu’une léthargie, une incapacité à atteindre l’eau ou la nourriture, une respiration laborieuse ou une diminution de la vigilance mentale n’a été observé. L’aspiration oropharyngée est une autre méthode d’administration directe de bactéries dans les poumons, bien que la résolution des lésions pulmonaires semble se produire plus rapidement et que certaines bactéries puissent se retrouver dans l’estomac et le tractus gastro-intestinal20.

Les modèles précliniques de PNA permettent aux chercheurs d’évaluer le paysage immunitaire. Les compartiments broncho-alvéolaires et interstitiels peuvent être évalués pour détecter des changements dynamiques dans les cellules immunitaires16. De plus, les cellules peuvent être cultivées et stimulées ex vivo pour déterminer leur production spécifique de cytokines et de chimiokines. Ici, nous nous concentrons sur l’exploration du paysage cellulaire immunitaire dans le poumon et le BAL en utilisant la cytométrie en flux multicolore. Le séquençage de l’ARN unicellulaire peut également être effectué pour comprendre les signatures transcriptomiques spécifiques des cellules à différents stades de la résolution des blessures.

Les modèles PNA-SDRA génèrent des effets systémiques qui peuvent être détectés tôt en mesurant le poids corporel au cours de la maladie10. Bien que nous ne mesurions pas directement les effets systémiques du SDRA, le dysfonctionnement des organes peut également être évalué par la mesure sanguine des profils chimiques et par le prélèvement de différents tissus tels que la rate, les reins et le foie pour l’histologie. Les effets systémiques du PNA-SDRA pneumococcique ont déjà été décrits par d’autres groupes utilisant la même souchebactérienne 21.

Ici, un modèle expérimental d’ANP qui ressemble à certains des principaux résultats physiopathologiques sous-jacents au SDRA humain est décrit. Bien qu’il n’existe pas de modèles idéaux qui récapitulent complètement la complexité et l’hétérogénéité du SDRAhumain 9, ces modèles sont pertinents et reproductibles pour l’étude des mécanismes de lésion et de réparation pulmonaires, servant également de plate-forme pour l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques potentielles axées sur l’accélération de la résolution de l’inflammation pulmonaire et la promotion de la réparation pulmonaire.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par la subvention R01 des NIH HL131812 et R01HL163881.

Materials

1-200 µL Round 0.5 mm Thick Gel-Loading Pipet Tips Corning 4853
2 mL Cryogenic vials Corning Incorporated 431420 2 mL self standing, round bottom, red cap, polypropylene
2 mL Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes Fisherscientific 05-402-24C Shape: Round, Length (Metric): 38mm, Diameter (Metric) Outer: 10mm, Capacity (Metric): 2mL
70 µm Cell Strainer Falcon 352350 White, Sterile, Individually Packaged
96-well Clear Round Bottom Falcon 353077  TC-treated Cell Culture Microplate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile
Acepromizine Maleate Injection, USP 500 mg/50 mL (10mg/mL) Phoenix NDC 57319-604-04 EACH mL CONTAINS: acepromazine maleate 10 mg, sodium citrate 0.36%, Citric acid 0.075%, benzyl alcohol 1% and water for injection.
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer Quality Biological 118-156-721 4 x 100mL
Anti-mouse I-A/I-E Biolegend 107628 APC/Cyanine7 anti-mouse I-A/I-E [M5/114.15.2]; Isotype: Rat IgG2b
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
BD Trypticase Soy Agar  BD-Biosciences 90001-276 5% Sheep Blood Prepared Media Stacker Plates, BD Diagnostics
Biotix Disposable Reagent Reservoirs Biotix 89511-194
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrih A4503
CD103 Invitrogen 509723 Integrin alpha E) Armenian Hamster anti-Mouse, FITC, Clone: 2E7
CD11b Invitrogen RM2817 PE-Texas Red, Clone: M1/70.15, Invitrogen
CD11c BD Biosciences 565872 Hamster anti-Mouse, APC-R700, Clone: N418, BD Horizon
CD19 Biolegend 152410 APC anti-mouse CD19 [1D3/CD19]; Isotype: Rat IgG2a, κ
CD24 BD Biosciences 563450 Rat anti-Mouse, Brilliant Violet 711, Clone: M1/69
CD4 BD Biosciences 563790 BUV395; Clone: GK1.5
CD45 Biolegend 103157 Brilliant Violet 750 anti-mouse CD45 [30-F11]; Isotype: Rat IgG2b, κ;
CD8a BD Biosciences 612759 Rat anti-Murine, Brilliant Ultraviolet 737, Clone: 53-6.7
Cell Counting Slides  Bio-rad 1450017 For TC20 Cell Counter
Cell strainer 70 µL Nylon Falcon 198718 REF 352350
Collagenase Type1  Worthington Biochemical Corporation LS004197
Culti-Loop Streptococcus pneumoniae  Thermo Scientific R4609015 ATCC 4961
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrih DN25
Disposable inoculation loops/needles Fisherbrand 22-363-603 Color blue; Volume 1 µL
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Corning 10-014-CV
Fc Block BD Biosciences 553142 CD16/CD32 Rat anti-Mouse, Unlabeled, Clone: 2.4G2
Formalin solution Sigma-Aldrih HT501640 Formalin solution, neutral buffered, 10%
Gauze Sponges, Covidien Curity 2146-
gentleMACS C Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-093-237
gentleMACS Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235 SN: 4715
Hema 3 Manual Staining System and Stat Pack Thermo Scientific  23123869
Isoflurane Liquid Inhalation Henry Schein 1182097
IV CATHETER JELCO 20GX1.25" Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc 405611
Ketamine HCl Injection Henry Schein 1049007 Ketamine HCl Injection MDV 100mg/mL 10mL 10/Box
Klebsiella pneumoniae  ATCC 43816 subsp. pneumoniae (Schroeter) Trevisan
Loctite 409 Electron Microscopy Sciences 7257009
Ly-6C Biolegend 128036 Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6C [HK1.4]; Isotype: Rat IgG2c
Ly-6G BD Biosciences 740157 Rat anti-Mouse, Brilliant Violet 510, Clone: 1A8, BD Optibuild
MiniVent Type 845 Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus 4694 D-79232 March (Germany)
NK-1.1 BD Biosciences 553165 Mouse anti-Mouse, PE, Clone: PK136, BD
Phase Hemacytometer Hausser Scientific 1475
Phosphate-Buffered Saline Corning 21-040-CV 1X without calcium and magnesium,
Round Bottom Sarstedt 55.476.305
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes  Falcon 352235 With Cell Strainer Snap Cap, 5mL
SealRite 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube USA Scientific 1615-5500 Free of detectable Rnase, DNase, DNA and pyrogens.
Shandon EZ Single Cytofunnel Epredia A78710003
Siglec-F BD Biosciences 562681 Anti-Mouse, Brilliant Violet 421, Clone: E50-2440
Silk Black Braided 30"(75 cm) Sterile, nonabsorbable surgical suture U.S.P. Ethicon K-834 0 (3.5 metric)
Stainless-Steel Slide Clip Epredia 59910052
Sterile Single Use Vacuum Filter Units Thermo Scientific 1660045
Syringe sterile, single use, 1 mL BD-Biosciences 309628
TC20 Automatic Cell Counter Bio-Rad 508BR05740
TipOne 200 ul yellow pipet tip refill USA Scientific 1111-0706
TODD HEWITT BROTH RPI T47500 
TPX Sample Chamber Epredia A78710018
TPX Single Sample Chamber, Caps and Filter Cards Epredia 5991022
Trypan Blue Bio-rad 1450022
U-100 Insulin Syringes BD-Biosciences 329461
Wet-Proof Multi-Heat Electric Heat Pad Cullus Model PR7791AB 120 volst AC; 45 watts; Listed 562B/E26869
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参考文献

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Villabona-Rueda, A., Wang, D., D’Alessio, F. R. Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia. J. Vis. Exp. (192), e63925, doi:10.3791/63925 (2023).
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