Химическая модификация остатка триптофана в рекомбинантном N-домене Ca²⁺-АТФазы для изучения триптофана-ANS FRET

Резонансный перенос энергии Фёстера (FRET) стал стандартным методом определения расстояния между молекулярными структурами после связывания или взаимодействия в белковой структуре и функциональных исследованиях^1,2,3,4. В АТФазах Р-типа FRET был использован для исследования структуры и функции сарко-эндоплазматического стикулума Ca²⁺-АТФазы (SERCA)^2,5,6,7,8,например, структурные флуктуации во время каталитического цикла были проанализированы во всем белке с помощью FRET^7.

Доноры FRET разнообразны и варьируются от небольших флуоресцентных (внешних) молекул до флуоресцентных белков^9,10. Остатки триптофана (Trp) (из-за их флуоресценции) полезны для выявления структурных изменений в белковых аминокислотных последовательностях^11,12. Интенсивность флуоресценции Trp существенно зависит от полярности окружающей его среды^13,14. Связывание лигандов обычно порождает структурные перестройки в белках/ферментах^15,16. Если Trp присутствует в месте связывания белка или расположен близко к нему, структурные колебания часто влияют на степень воздействия Trp на водные среды^13,14; таким образом, изменение полярности приводит к гашению интенсивности флуоресценции Trp^13,14. Следовательно, флуоресцентное свойство Trp полезно для проведения исследований связывания лигандов для ферментов. Другие физические явления могут также привести к закалке флуоресценции Trp^17,18,19,20,например, FRET и изменениям средней полярности. Передача энергии из возбужденного состояния Trp во флуорофор также имеет потенциальное применение, например, определение аффинности малых лигандов в белках^21. Действительно, Trp в основном использовался в качестве флуоресцентного донора в исследованиях FRET в белках^22,23,24,например, в исследованиях TERBium (Tb³⁺⁾FRET, остаток Trp часто используется в качестве антенны для передачи энергии tb^{3 +25,26,27}. Trp демонстрирует различные преимущества перед другими донорами FRET благодаря присущему ему конститутивному характеру в структуре белка, что исключает необходимость в препаративных процессах, которые могут влиять на функцию/структуру исследуемого белка^24. Таким образом, идентификация радиационных распадов (перенос энергии и изменения полярности среды, которые индуцируются структурными перестройками белка) важна для получения точных выводов относительно связывания лигандов в структурных исследованиях белка^13,14,19,28.

В исследованиях структуры белка внешний флуорофор, а именно 8-анилино-1-нафталинсульфонат (НС), в основном использовался в экспериментах, связанных со сворачиванием/развертыванием белка^28,29. ВСС связывается с белками/ферментами в нативном состоянии, обычно в местах связывания субстратов^31,32,33; увеличение квантового выхода флуоресценции ВНС (ΦF) (а именно увеличение интенсивности флуоресценции) индуцируется возбуждением белка при λ=370 нм, когда подходящие взаимодействия НС с Arg и его остатками в гидрофобных карманах происходят^34,35,36,37. В различных исследованиях сообщалось о возникновении FRET (при возбуждении при λ в пределах 280-295 нм) между остатками Trp (донорами) и ANS (акцептором), что основано на следующем: 1) перекрытии спектра флуоресцентного излучения Trp и спектра возбуждения ANS, 2) идентификации подходящего расстояния между одним или несколькими остатками Trp и ANS для передачи энергии, 3) высокий квантовый выход ВСС при связывании в белковых карманах и 4) характерный паттерн FRET в спектрах флуоресценции белка в присутствии^{ANS 3,17,27,37,38.}

В последнее время связывание лигандов с нуклеотидсвязывающим доменом (N-доменом) в SERCA и других АТФазах P-типа было исследовано с использованием инженерных рекомбинантных N-доменов^{40,41,42,43,44,45,46.} Молекулярная инженерия N-домена SERCA была использована для перемещения единственного остатка Trp (Trp552Leu) в более динамичную структуру (Tyr587Trp), которая близка к нуклеотид-связывающему сайту, где вариации флуоресценции (гашение) могут быть использованы для мониторинга структурных изменений при связывании лиганда^34. Экспериментальные результаты показали, что ВНС связывается (как АТФ) с нуклеотид-связывающим сайтом в очищенном рекомбинантном N-домене SERCA^{N 34.} Интересно, что флуоресценция ANS увеличивается при связывании с N-доменом при возбуждении при λ 295 нм, в то время как внутренняя флуоресценция N-домена уменьшается^{на 34,}тем самым создавая паттерн FRET, который предполагает образование пары Trp-ANS FRET.

Предложено использовать НБС для определения содержания остатков Trp в белках⁴⁷ путем анализа абсорбции модифицированных белков. NBS модифицирует высокоабсорбировку индоловой группы Trp на менее абсорбирующий оксиндол^47,48. Это приводит к потере (закалке) флуоресцентного свойства Trp^40. Следовательно, Опосредованная NBS химическая модификация остатков Trp может быть использована в качестве анализа для определения роли Trp (как донора), когда freT выдвигается гипотеза.

Этот протокол описывает химическую модификацию единственного остатка Trp NBS в спроектированном рекомбинантном N-домене SERCA в качестве белковой модели. Экспериментальные результаты показывают, что интенсивность флуоресценции ANS все еще увеличивается в химически модифицированном NBS N-домене^34,которому не хватает внутренней флуоресценции. Поэтому анализ полезен для демонстрации отсутствия FRET между остатком Trp и ANS при связывания с N-доменом^34,40,49. Следовательно, этот анализ (NBS химическая модификация Trp) полезен для доказательства присутствия пары Trp-ANS FRET в белках.