Modifica chimica del residuo di triptofano in un dominio N Ricombinante Ca²⁺-ATPasi per lo studio del triptofano-ANS FRET

Il trasferimento di energia di risonanza di Föster (FRET) è diventato una tecnica standard per determinare la distanza tra le strutture molecolari dopo il legame o l’interazione negli studi di struttura e funzione delle proteine^1,2,3,4. Nelle ATPasi di tipo P, FRET è stato utilizzato per studiare la struttura e la funzione del reticolo sarco-endoplasmatico Ca²⁺-ATPasi (SERCA)^2,5,6,7,8, ad esempio, le fluttuazioni strutturali durante il ciclo catalitico sono state analizzate nell’intera proteina da FRET⁷.

I donatori di FRET sono diversi e vanno da piccole molecole fluorescenti (estrinseche) a proteine fluorescenti^9,10. I residui di triptofano (Trp) (dovuti alla loro fluorescenza) sono utili per identificare i cambiamenti strutturali nelle sequenze di aminoacidi proteici^11,12. L’intensità di fluorescenza del Trp dipende sostanzialmente dalla polarità dell’ambiente^{circostante13,14.} Il legame del ligando di solito genera riarrangiamenti strutturali in^{proteine/enzimi 15,16.} Se Trp è presente o situato vicino al sito di legame proteico, le fluttuazioni strutturali influenzano frequentemente il grado di esposizione di Trp ai mezzi acquosi^13,14; quindi, il cambiamento di polarità provoca l’tempra dell’intensità di fluorescenza Trp^13,14. Quindi, la proprietà fluorescente di Trp è utile per eseguire studi di legame del ligando per gli enzimi. Altri fenomeni fisici possono anche portare alla tempra di fluorescenza Trp^17,18,19,20, ad esempio, FRET e cambiamenti nella polarità media. Il trasferimento di energia dallo stato eccitato di Trp a un fluoroforo ha anche potenziali applicazioni, ad esempio la determinazione dell’affinità di piccoli ligandi nelle proteine²¹. Infatti, Trp è stato utilizzato principalmente come donatore di fluorescenza negli studi FRET nelle proteine^22,23,24, ad esempio, negli studi FRET sul terbio (Tb^{3 +),}un residuo Trp viene utilizzato frequentemente come antenna per il trasferimento di energia a Tb^{3 +25,26,27}. Trp mostra vari vantaggi rispetto ad altri donatori di FRET a causa del suo carattere costitutivo intrinseco nella struttura proteica, che elimina la necessità di processi preparativi che possono influenzare la funzione / struttura della proteina²⁴studiata. Pertanto, l’identificazione dei decadimenti radiativi (trasferimento di energia e cambiamenti nella polarità media indotti da riarrangiamenti strutturali proteici) è importante per trarre conclusioni accurate sul legame del ligando negli studi strutturali sulle proteine^13,14,19,28.

Negli studi strutturali sulle proteine, un fluoroforo estrinseco, vale a dire 8-anilino-1-naftalene solfonato (ANS), è stato utilizzato principalmente in esperimenti relativi al ripiegamento / dispiegamento delle proteine^28,29. ANS si lega a proteine/enzimi allo stato nativo, solitamente nei siti di legame dei substrati^31,32,33; un aumento della resa quantistica di fluorescenza ANS (ΦF) (vale a dire, un aumento dell’intensità di fluorescenza) è indotto dall’eccitante proteina a λ = 370 nm quando si verificano interazioni adeguate di ANS con Arg e i suoi residui in tasche idrofobiche^34,35,36,37. In vari studi, è stata segnalata la presenza di FRET (quando eccitante a λ entro 280-295 nm) tra residui di Trp (donatori) e ANS (accettore), che si basa su quanto segue: 1) sovrapposizione dello spettro di emissione di fluorescenza di Trp e spettro di eccitazione di ANS, 2) identificazione di una distanza adeguata tra uno o più residui di Trp e ANS per il trasferimento di energia, 3) elevata resa quantistica ANS quando legata in sacche proteiche, e 4) pattern FRET caratteristico negli spettri di fluorescenza della proteina in presenza di ANS^{3,17,27,37,38.}

Recentemente, il legame del ligando al dominio di legame nucleotidico (dominio N) in SERCA e altre ATPasi di tipo P sono stati studiati utilizzando N-domini N ricombinanti ingegnerizzati^{40,41,42,43,44,45,46.} L’ingegneria molecolare del dominio N SERCA è stata utilizzata per spostare l’unico residuo Trp (Trp552Leu) in una struttura più dinamica (Tyr587Trp) che è vicina al sito di legame nucleotidico, dove le variazioni di fluorescenza (tempra) possono essere utilizzate per monitorare i cambiamenti strutturali sul legame del ligando³⁴. I risultati sperimentali hanno dimostrato che ANS si lega (come ATP) al sito di legame nucleotidico nel ricombinante purificato SERCA N-domain³⁴. È interessante notare che la fluorescenza ANS aumenta quando si lega al dominio N all’eccitazione a un λ di 295 nm, mentre la fluorescenza intrinseca del dominio N diminuisce^{di 34}, producendo così un modello FRET che suggerisce la formazione di una coppia Trp-ANS FRET.

L’uso di NBS è stato proposto per determinare il contenuto di residui di Trp nelle proteine⁴⁷ mediante il saggio di assorbanza di proteine modificate. NBS modifica il gruppo indolo altamente assorbente di Trp al meno assorbente^{ossindolo 47,48.} Ciò si traduce nella perdita (spegnimento) della proprietà fluorescente Trp⁴⁰. Quindi, la modifica chimica mediata da NBS dei residui di Trp può essere utilizzata come saggio per definire il ruolo di Trp (come donatore) quando si ipotizza FRET.

Questo protocollo descrive la modifica chimica dell’unico residuo di Trp da parte di NBS nel dominio N ricombinante ingegnerizzato di SERCA come modello proteico. I risultati sperimentali dimostrano che l’intensità di fluorescenza ANS aumenta ancora nel dominio N³⁴modificato chimicamente NBS, che manca di fluorescenza intrinseca. Pertanto, il saggio è utile per dimostrare l’assenza di FRET tra il residuo Trp e ANS quando legato al dominio N^34,40,49. Quindi, questo test (modifica chimica NBS di Trp) è utile per dimostrare la presenza della coppia Trp-ANS FRET nelle proteine.