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生化学

Modification chimique du résidu de tryptophane dans un domaine N recombinant Ca2+-ATPasepour l’étude du tryptophane-ANS FRET

Published: October 09, 2021
doi:
10.3791/62770
,
1Instituto de Física,Universidad Autónoma de San Luis Potosí

概要

ANS se lie au domaine N recombinant Ca2+-ATPase. Les spectres de fluorescence affichent un motif de type FRET lors de l’excitation à une longueur d’onde de 295 nm. La modification chimique du Trp médiée par le NBS éteint la fluorescence du domaine N, ce qui conduit à l’absence de transfert d’énergie (FRET) entre le résidu Trp et le SNA.

Abstract

Le sarco/réticulum endoplasmique Ca2+-ATPase (SERCA) est une ATPase de type P qui a été cristallisée en diverses conformations. Des informations fonctionnelles détaillées peuvent néanmoins être obtenues à partir de domaines recombinants isolés. Le domaine de liaison aux nucléotides recombinants (domaine N) (Trp552Leu et Tyr587Trp) d’ingénierie (Trp552Leu et Tyr587Trp) affiche une trempe par fluorescence lors de la liaison au ligand. Un fluorophore extrinsèque, à savoir le sulfonate de 8-anilino-1-naphtalène (SNA), se lie au site de liaison aux nucléotides par des interactions électrostatiques et hydrophobes avec les résidus d’Arg, His, Ala, Leu et Phe. La liaison ANS est mise en évidence par l’augmentation de l’intensité de fluorescence lorsqu’elle est excitée à une longueur d’onde (λ) de 370 nm. Cependant, lorsqu’il est excité à λ de 295 nm, l’augmentation de l’intensité de fluorescence semble être couplée à la trempe de la fluorescence intrinsèque du domaine N. Les spectres de fluorescence présentent un modèle de transfert d’énergie de résonance de Föster (FRET), suggérant ainsi la présence d’une paire Trp-ANS FRET, qui semble être soutenue par la courte distance (~20 Å) entre Tyr587Trp et ANS. Cette étude décrit une analyse de la paire Trp-ANS FRET par modification chimique Trp (et trempe par fluorescence) qui est médiée par le N-bromosuccinimide (NBS). Dans le domaine N chimiquement modifié, la fluorescence ANS augmentait lorsqu’elle était excitée à un λ de 295 nm, de la même manière que lorsqu’elle était excitée à un λ de 370 nm. Par conséquent, la modification chimique médiée par le NBS du résidu de Trp peut être utilisée pour sonder l’absence de FRET entre Trp et ANS. En l’absence de fluorescence Trp, il ne faut pas observer une augmentation de la fluorescence ANS. La modification chimique des résidus de Trp dans les protéines par le NBS peut être utile pour examiner le FRET entre les résidus de Trp qui sont proches du SNA lié. Ce test sera probablement également utile lors de l’utilisation d’autres fluorophores.

Introduction

Le transfert d’énergie par résonance de Föster (FRET) est devenu une technique standard pour déterminer la distance entre les structures moléculaires après liaison ou interaction dans les études de structure et de fonction des protéines1,2,3,4. Dans les ATPases de type P, FRET a été utilisé pour étudier la structure et la fonction du réticulum sarco-endoplasmique Ca2+-ATPase (SERCA)2,5,6,7,8, par exemple, les fluctuations structurelles au cours du cycle catalytique ont été analysées dans la protéine entière par FRET7.

Les donneurs fret sont divers, et vont des petites molécules fluorescentes (extrinsèques) aux protéines fluorescentes9,10. Les résidus de tryptophane (Trp) (en raison de leur fluorescence) sont utiles pour identifier les changements structurels dans les séquences d’acides aminés protéiques11,12. L’intensité de fluorescence du Trp dépend substantiellement de la polarité de son environnement13,14. La liaison aux ligands génère généralement des réarrangements structurels dans les protéines/enzymes15,16. Si le Trp est présent au site de liaison aux protéines ou situé à proximité decelui-ci,les fluctuations structurelles affectent fréquemment le degré d’exposition au Trp aux milieux aqueux13,14; ainsi, le changement de polarité entraîne la trempe de l’intensité de fluorescence Trp13,14. Par conséquent, la propriété fluorescente de Trp est utile pour effectuer des études de liaison aux ligands pour les enzymes. D’autres phénomènes physiques peuvent également conduire à la trempe par fluorescence Trp17,18,19,20, par exemple FRET et changements de polarité moyenne. Le transfert d’énergie de l’état excité de Trp à un fluorophore a également des applications potentielles, par exemple, la détermination de l’affinité de petits ligands dans les protéines21. En effet, le Trp a été principalement utilisé comme donneur de fluorescence dans les études FRET danslesprotéines22,23,24,par exemple, dans les études FRET au terbium (Tb3+),un résidu de Trp est fréquemment utilisé comme antenne pour le transfert d’énergie vers Tb3+25,26,27. Trp présente divers avantages par rapport aux autres donneurs de FRET en raison de son caractère constitutif inhérent à la structure protéique, ce qui élimine le besoin de processus préparatoires pouvant affecter la fonction / structure de la protéine étudiée24. Ainsi, l’identification des désintégrations radiatives (transfert d’énergie et changements de polarité moyenne induits par des réarrangements structurels des protéines) est importante pour tirer des conclusions précises concernant la liaison aux ligands dans les études structurales des protéines13,14,19,28.

Dans les études structurales des protéines, un fluorophore extrinsèque, à savoir le 8-anilino-1-naphtalène sulfonate (ANS), a été principalement utilisé dans des expériences liées au repliement/déploiement des protéines28,29. Le SNA se lie aux protéines/enzymes à l’état natif, généralement dans les sites de liaison des substrats31,32,33; une augmentation du rendement quantique de fluorescence ANS (ΦF) (à savoir, une augmentation de l’intensité de fluorescence) est induite par l’excitation de la protéine à λ = 370 nm lorsque des interactions appropriées de l’ANS avec Arg et ses résidus dans les poches hydrophobes se produisent34,35,36,37. Dans diverses études, l’apparition de FRET (lorsqu’elle est excitante à λ dans les 280-295 nm) entre les résidus de Trp (donneurs) et le SNA (accepteur) a été rapportée, qui est basée sur les éléments suivants: 1) chevauchement du spectre d’émission de fluorescence du Trp et du spectre d’excitation du SNA, 2) identification d’une distance appropriée entre un ou plusieurs résidus de Trp et ANS pour le transfert d’énergie, 3) rendement quantique ANS élevé lorsqu’il est lié dans des poches de protéines, et 4) motif FRET caractéristique dans les spectres de fluorescence de la protéine en présence de ANS3,17,27,37,38.

Récemment, la liaison des ligands au domaine de liaison aux nucléotides (domaine N) dans SERCA et d’autres ATPases de type P a été étudiée à l’aide des domaines N recombinants40,41,42,43,44,45,46. L’ingénierie moléculaire du domaine N SERCA a été utilisée pour déplacer le seul résidu de Trp (Trp552Leu) vers une structure plus dynamique (Tyr587Trp) proche du site de liaison aux nucléotides, où les variations de fluorescence (trempe) peuvent être utilisées pour surveiller les changements structurels lors de la liaison au ligand34. Les résultats expérimentaux ont démontré que l’ANS se lie (sous forme d’ATP) au site de liaison aux nucléotides dans le domaine N34du SERCA recombinant purifié. Fait intéressant, la fluorescence ANS augmente lors de la liaison au domaine N lors de l’excitation à un λ de 295 nm, tandis que la fluorescence intrinsèque du domaine N diminuede 34,produisant ainsi un motif FRET qui suggère la formation d’une paire Trp-ANS FRET.

L’utilisation du NBS a été proposée pour déterminer la teneur en résidus de Trp dans les protéines47 par dosage d’absorbance de protéines modifiées. NBS modifie le groupe indole hautement absorbant de Trp en oxindole moins absorbant47,48. Il en résulte la perte (trempe) de la propriété fluorescente Trp40. Par conséquent, la modification chimique des résidus de Trp médiée par le NBS peut être utilisée comme essai pour définir le rôle du Trp (en tant que donneur) lorsque FRET est hypothétisé.

Ce protocole décrit la modification chimique du seul résidu de Trp par NBS dans le domaine N recombinant de SERCA en tant que modèle protéique. Les résultats expérimentaux démontrent que l’intensité de fluorescence ANS augmente encore dans le domaine N34modifié chimiquement par le NBS, qui manque de fluorescence intrinsèque. Par conséquent, le test est utile pour démontrer l’absence de FRET entre le résidu Trp et ANS lorsqu’il est lié au domaine N34,40,49. Par conséquent, ce test (modification chimique NBS de Trp) est utile pour prouver la présence de la paire Trp-ANS FRET dans les protéines.

Protocol

1. Détermination (in silico) de l’interaction ans et SERCA du domaine N Générer une structure tridimensionnelle (3D) de la protéine (domaine N SERCA) par modélisation moléculaire à l’aide du logiciel de modélisation protéique préféré50. Identifier les résidus d’acides aminés qui forment le site de liaison aux nucléotides à l’aide du logiciel de structure moléculaire préféré51, et déterminer la présence de résidus A…

Representative Results

L’amarrage moléculaire montre la liaison de l’ANS au site de liaison aux nucléotides du domaine N via des interactions électrostatiques et hydrophobes(Figure 1). La distance moléculaire (20 Å) entre le résidu Trp et le SNA (lié au site de liaison aux nucléotides) soutient l’apparition de FRET (Figure 1). Le domaine N recombinant conçu (conçu) a été obtenu à haute pureté par chromatographie d’affinité(Figure 2)…

Discussion

Les spectres de fluorescence du complexe ans-N-domaine présentent un motif de type FRET lorsqu’ils sont excités à un λ de 295 nm, tandis que la distance moléculaire (20 Å) entre le résidu Trp et ANS semble soutenir l’apparition de FRET (Figure 1). La modification chimique du Trp par le NBS donne un domaine N moins fluorescent(Figure 3B, Spectre f); par conséquent, le transfert d’énergie n’est pas possible. Les spectres de fluorescence ANS sont s…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été partiellement financé par le numéro de subvention FAI-UASLP C19-FAI-05-89.89 et le numéro de subvention CONACYT 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Les auteurs remercient l’assistance technique de Julian E. Mata-Morales en édition vidéo.

Materials

Acrylamide Bio-Rad 1610107 SDS-PAGE
Ammonium persulfate Bio-Rad 1610700 SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid Sigma-Aldrich A1028 Fluorophore
Bis-acrylamide Bio-Rad 1610125 SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide Sigma-Aldrich B81255 Chemical modification
N,N-dimethylformamide J.T. Baker 9213-12 Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F7250 Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette Hellma Z801291 Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer Shimadzu RF 5301PC Fluorescence assay
HisTrap™ FF GE Healtcare 11-0004-59 Protein purification
IPTG, Dioxane free American Bionalytical AB00841-00010 Protein expression
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G Protein purification
LB media Fisher Scientific 10000713 Cell culture
Pipetman L P10L Gilson FA10002M Fluorescence assay
Pipetman L P100L Gilson FA10004M Fluorescence assay
Pipetman L P200L Gilson FA10005M Fluorescence assay
Pipetman L P1000L Gilson FA10006M Fluorescence assay
Pipetman L P5000L Gilson FA10007 Fluorescence assay
Precision plus std Bio-Rad 1610374 SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate Bio-Rad 1610302 SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic J.T. Baker 3828-19 Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic J.T. Baker 3818-01 Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um Millipore GVWP04700 Solution filtration
Temed Bio-Rad 1610801 SDS-PAGE
Tris Bio-Rad 1610719 SDS-PAGE
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参考文献

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Sampedro, J. G., Cataño, Y. Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET. J. Vis. Exp. (176), e62770, doi:10.3791/62770 (2021).
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