Modificação química do resíduo de triptofano em um recombinante Ca²⁺-ATPase N-domínio para estudar triptofano-ANS FRET

A transferência de energia de ressonância föster (FRET) tornou-se uma técnica padrão para determinar a distância entre estruturas moleculares após a ligação ou interação em estudos de estrutura proteica e função^1,2,3,4. Em ATPases tipo P, o FRET tem sido utilizado para investigar a estrutura e a função do ânticulum sarco-endoplasmático Ca²⁺-ATPase (SERCA)^2,5,6,7,8, por exemplo, flutuações estruturais durante o ciclo catalítico foram analisadas em toda a proteína pelo FRET⁷.

Os doadores de FRET são diversos, e variam de pequenas moléculas fluorescentes (extrínsecas) a proteínas fluorescentes^9,10. Os resíduos de triptofano (Trp) (devido à sua fluorescência) são úteis para identificar alterações estruturais nas sequências de aminoácidos proteicos^11,12. A intensidade de fluorescência do Trp depende substancialmente da polaridade de seu ambiente circundante^13,14. A ligação de ligante geralmente gera rearranjos estruturais em proteínas/enzimas^15,16. Se o Trp estiver presente ou localizado próximo ao local de ligação proteica, as flutuações estruturais frequentemente afetam o grau de exposição de Trp à mídia aquosa^13,14; assim, a mudança na polaridade resulta na saciedade da intensidade de fluorescência trp^13,14. Assim, a propriedade fluorescente do Trp é útil para a realização de estudos de ligação de ligantes para enzimas. Outros fenômenos físicos também podem levar à fluorescência trp saciando^17,18,19,20, por exemplo, FRET e mudanças na polaridade média. A transferência de energia do estado animado de Trp para um fluoróforo também tem aplicações potenciais, por exemplo, determinação de afinidade de pequenos ligantes em proteínas²¹. De fato, o Trp tem sido usado principalmente como doador de fluorescência em estudos de FRET em proteínas^22,23,24, por exemplo, em estudos de terbium (Tb³⁺⁾FRET, um resíduo de Trp é usado frequentemente como antena para transferência de energia para Tb^3+25,26,27. A Trp apresenta várias vantagens sobre outros doadores de FRET devido ao seu caráter constitutivo inerente à estrutura proteica, o que elimina a necessidade de processos preparatórios que possam afetar a função/estrutura da proteína estudada²⁴. Assim, a identificação de decaimentos radiativos (transferência de energia e mudanças na polaridade média que são induzidas por rearranjos estruturais proteicos) é importante para tirar conclusões precisas sobre ligaduras em estudos estruturais proteicos^13,14,19,28.

Em estudos estruturais proteicos, um fluoróforo extrínseco, ou seja, 8-anilino-1-naftalina sulfonato (ANS), tem sido usado principalmente em experimentos relacionados a dobra/desdobramento de proteínas^28,29. A ANS se liga a proteínas/enzimas no estado nativo, geralmente nos locais de ligação dos substratos^31,32,33; um aumento no rendimento quântico da fluorescência ans (ΦF) (ou seja, um aumento na intensidade da fluorescência) é induzido por excitar a proteína em λ=370 nm quando interações adequadas de ANS com Arg e Seus resíduos em bolsões hidrofóbicos ocorrem^34,35,36,37. Em diversos estudos, foi relatada a ocorrência de FRET (quando excitante no λ dentro de 280-295 nm) entre resíduos de Trp (doadores) e ANS (aceitador), que se baseia no seguinte: 1) sobreposição do espectro de emissão de fluorescência de Trp e espectro de excitação da ANS, 2) identificação de uma distância adequada entre um ou mais resíduos Trp(s) e ANS para transferência de energia, 3) alto rendimento quântico ans quando ligado em bolsões de proteína, e 4) padrão de FRET característico no espectro de fluorescência da proteína na presença de ANS^{3,17,27,37,38}.

Recentemente, a vinculação de ligantes ao domínio de ligação nucleotídea (n-domínio) em SERCA e outros ATPases do tipo P foram investigadas utilizando n-domínios recombinantes projetados^{40,41,42,43,44,45,46}. A engenharia molecular do domínio N da SERCA tem sido usada para mover o único resíduo de Trp (Trp552Leu) para uma estrutura mais dinâmica (Tyr587Trp) que esteja próxima ao local de ligação de nucleotídeos, onde variações de fluorescência (saciamento) podem ser usadas para monitorar alterações estruturais na ligação³⁴. Os resultados experimentais demonstraram que a ANS se liga (como ATP) ao local de ligação nucleotídea no recombinante purificado SERCA N-domínio³⁴. Curiosamente, a fluorescência ANS aumenta ao vincular-se ao domínio N após a excitação a um λ de 295 nm, enquanto a fluorescência intrínseca do domínio N diminui³⁴, produzindo assim um padrão FRET que sugere a formação de um par Trp-ANS FRET.

O uso de NBS foi proposto para determinar o conteúdo de resíduos de Trp em proteínas⁴⁷ por ensaio de absorvância de proteínas modificadas. NBS modifica o grupo indol altamente absorvente de Trp para o oxindole menos absorvente^47,48. Isso resulta na perda (saciamento) da propriedade fluorescente Trp⁴⁰. Assim, a modificação química mediada pelo NBS de resíduos de Trp pode ser usada como ensaio para definir o papel do Trp (como doador) quando o FRET é hipótese.

Este protocolo descreve a modificação química do único resíduo de Trp por NBS no recombinante N-domínio da SERCA como modelo proteico. Os resultados experimentais demonstram que a intensidade da fluorescência ans ainda aumenta no n-domínio^{34 quimicamente}modificado por NBS, que carece de fluorescência intrínseca. Portanto, o ensaio é útil para demonstrar a ausência de TRAS entre o resíduo Trp e o ANS quando vinculado ao n-domínio^34,40,49. Assim, este ensaio (modificação química NBS de Trp) é útil para provar a presença do par Trp-ANS FRET em proteínas.