Visualización de Pseudomonas aeruginosa en el esputo de pacientes con fibrosis quística

En este estudio, se diseñaron experimentos para visualizar la estructura in vivo de Pseudomonas aeruginosa dentro del esputo de pacientes pediátricos con fibrosis quística (FQ). Las infecciones por P. aeruginosa se vuelven crónicas en el 30-40% de la población pediátrica con FQ; Una vez que las infecciones crónicas se establecen, son casi imposibles de eliminar¹. Los aislados de P. aeruginosa de pacientes con infección temprana son generalmente más susceptibles a los antimicrobianos, por lo tanto, estos se tratan con antibióticos antipseudomonales para prevenir el establecimiento de infección crónica². Desafortunadamente, no todos los aislados de P. aeruginosa se eliminan eficazmente del pulmón después de la terapia con antibióticos. Los mecanismos precisos asociados con el fracaso de los antibióticos no se han dilucidado por completo. Estudios previos han demostrado que las variaciones en la densidad celular de la biopelícula, la agregación y la producción de polisacáridos pueden^{afectar la eficacia} de los antibióticos. P. aeruginosa produce tres polisacáridos extracelulares: Pel, Psl y alginato⁴. La mayoría de las cepas de P. aeruginosa tienen la capacidad genética de expresar cada uno de los exopolisacáridos, aunque a menudo un tipo de polisacárido se expresa predominantemente⁵. El alginato de exopolisacárido se asocia con infecciones crónicas en el pulmón de FQ, lo que resulta en un fenotipo mucoide ^6,7. Los polisacáridos Pel y Psl tienen múltiples funciones, entre ellas ayudar a la unión inicial y al mantenimiento de la estructura de la biopelícula, y conferir resistencia a los antibióticos⁸.

Se han desarrollado métodos dirigidos a visualizar in vivo las estructuras de los tejidos para una variedad de tipos de muestras 9,10,11. Más recientemente, se han adaptado para visualizar las comunidades microbianas in vivo dentro del esputo de pacientes con FQ¹². La optimización de un protocolo de limpieza de tejidos específicamente para la identificación de comunidades microbianas dentro del esputo fue desarrollada por DePas et al., 2016¹². El término MiPACT, que significa identificación microbial idespués de la tecnología de la LERA de Pa sive,se acuñó para la eliminación del esputo de FQ ^11,12. En el caso de las técnicas de limpieza de tejidos, las muestras se fijan primero y luego se vuelven transparentes, dejando intacta su arquitectura inherente para la tinción y la visualización microscópica¹¹. La fijación y eliminación de muestras de esputo de FQ permite a los investigadores responder preguntas relacionadas con la estructura de la biopelícula, la densidad celular bacteriana, las asociaciones polimicrobianas y las asociaciones entre patógenos y células huésped. La ventaja de examinar directamente las bacterias que se han conservado dentro del esputo es que pueden analizarse y visualizarse en un contexto específico del huésped. Aunque el crecimiento in vitro de aislados clínicos en el laboratorio para la experimentación puede ser muy informativo, estos métodos no pueden recrear completamente el entorno pulmonar de la FQ, lo que resulta en una desconexión entre los resultados de laboratorio y los resultados de los pacientes.

Los métodos presentados aquí se pueden utilizar para fijar y eliminar el esputo para visualizar las bacterias, ya sea de pacientes con FQ o pacientes con otras infecciones respiratorias. El tipo específico de tinción y análisis microscópico descrito en este documento es la hibridación fluorescente in situ (FISH), seguida de la unión anti-Psl-anticuerpo dentro del hidrogel y el análisis posterior mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM). Después de la limpieza de tejidos, también se pueden aplicar otros métodos de inmunohistoquímica y microscopía.