يوفر هذا البروتوكول طرقا لتصور الخلايا البكتيرية ومجمع تخليق السكاريد (Psl) داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي.
يمكن أن يقلل الاكتشاف المبكر والقضاء على الزائفة الزنجارية داخل رئتي مرضى التليف الكيسي من فرصة الإصابة بعدوى مزمنة. يرتبط تطور عدوى P. aeruginosa المزمنة بانخفاض وظائف الرئة وزيادة المراضة. لذلك ، هناك اهتمام كبير بتوضيح أسباب الفشل في القضاء على P. aeruginosa بالعلاج بالمضادات الحيوية الذي يحدث في حوالي 10-40 ٪ من مرضى الأطفال. أحد العوامل العديدة التي يمكن أن تؤثر على تصفية العائل من المتصورة الزنجارية وقابلية المضادات الحيوية هو الاختلافات في التنظيم المكاني (مثل التجميع أو تكوين الأغشية الحيوية) وإنتاج السكريات. لذلك ، كنا مهتمين بتصور الخصائص الموضعية ل P. aeruginosa داخل بلغم مرضى التليف الكيسي. تم تطبيق تقنية إزالة الأنسجة على عينات البلغم بعد تضمين العينات في مصفوفة هيدروجيل للاحتفاظ بهياكل 3D بالنسبة للخلايا المضيفة. بعد إزالة الأنسجة ، تمت إضافة ملصقات الفلورسنت والأصباغ للسماح بالتصور. تم إجراء التهجين الفلوري في الموقع لتصور الخلايا البكتيرية ، وربط الأجسام المضادة المضادة ل PSL ذات العلامات الفلورية لتصور عديد السكاريد الخارجي وتلطيخ DAPI لتلطيخ الخلايا المضيفة للحصول على رؤية هيكلية. سمحت هذه الطرق بالتصوير عالي الدقة ل P. aeruginosa داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي عبر الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر.
في هذه الدراسة ، تم تصميم التجارب لتصور البنية في الجسم الحي ل Pseudomonas aeruginosa داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي للأطفال (CF). تصبح عدوى P. aeruginosa مزمنة في 30-40 ٪ من السكان المصابين بالتليف الكيسي لدى الأطفال. بمجرد أن تصبح العدوى المزمنة ثابتة ، يكاد يكون من المستحيل القضاء عليها1. تكون عزلات P. aeruginosa من المرضى الذين يعانون من العدوى المبكرة أكثر عرضة بشكل عام لمضادات الميكروبات ، وبالتالي ، يتم علاجها بالمضادات الحيوية المضادة للزائفة لمنع حدوث عدوى مزمنة2. لسوء الحظ ، لا يتم إزالة جميع عزلات P. aeruginosa بشكل فعال من الرئة بعد العلاج بالمضادات الحيوية. لم يتم توضيح الآليات الدقيقة المرتبطة بفشل المضادات الحيوية بشكل كامل. أظهرت الدراسات السابقة أن الاختلافات في كثافة خلايا الأغشية الحيوية والتجميع وإنتاج السكريات يمكن أن تؤثر على فعالية المضادات الحيوية3. تنتج P. aeruginosa ثلاثة سكريات خارج الخلية: Pel و Psl والجينات4. معظم سلالات P. aeruginosa لديها القدرة الوراثية للتعبير عن كل من عديدات السكاريد الخارجية ، على الرغم من أنه غالبا ما يتم التعبير عن نوع واحد من السكريات في الغالب5. يرتبط ألجينات السكاريد الخارجية بالتهابات مزمنة في رئة التليف الكيسي ، مما يؤدي إلى النمط الظاهري المخاطي 6,7. السكريات Pel و Psl لها وظائف متعددة بما في ذلك المساعدة في التعلق الأولي والحفاظ على بنية الأغشية الحيوية ، ومنح مقاومة المضادات الحيوية8.
تم تطوير طرق تهدف إلى تصور هياكل الأنسجة في الجسم الحي لمجموعة متنوعة من أنواع العينات9،10،11. في الآونة الأخيرة ، تم تصميمها لتصور المجتمعات الميكروبية في الجسم الحي داخل البلغم من مرضى التليف الكيسي12. تم تطوير تحسين بروتوكول إزالة الأنسجة خصيصا لتحديد المجتمعات الميكروبية داخل البلغم بواسطة DePas et al.، 201612. تمت صياغة مصطلح MiPACT ، الذي يرمز إلى microbial iتحديد بعد Passive CLARITY technique لإزالة البلغم CF11,12. بالنسبة لتقنيات إزالة الأنسجة ، يتم تثبيت العينات أولا ، ثم يتم جعلها شفافة مع ترك بنيتها المتأصلة سليمة للتلطيخ والتصور المجهري11. يسمح تثبيت عينات البلغم CF وإزالتها للباحثين بالإجابة على الأسئلة المتعلقة ببنية الأغشية الحيوية ، وكثافة الخلايا البكتيرية ، والارتباطات متعددة الميكروبات ، والارتباطات بين مسببات الأمراض والخلايا المضيفة. ميزة الفحص المباشر للبكتيريا التي تم الحفاظ عليها داخل البلغم هي أنه يمكن تحليلها وتصورها في سياق خاص بالمضيف. على الرغم من أن النمو في المختبر للعزلات السريرية في المختبر للتجربة يمكن أن يكون مفيدا للغاية ، إلا أن هذه الأساليب غير قادرة على إعادة إنشاء بيئة الرئة التليف الكيسي بالكامل ، مما يؤدي إلى انفصال بين نتائج المختبر ونتائج المرضى.
يمكن استخدام الطرق المعروضة هنا لإصلاح وإزالة البلغم لتصور البكتيريا ، سواء من مرضى التليف الكيسي أو المرضى الذين يعانون من التهابات الجهاز التنفسي الأخرى. النوع المحدد من التلوين والتحليل المجهري الموصوف هنا هو التهجين الفلوري في الموقع (FISH) ، يليه ارتباط الأجسام المضادة ل PSL داخل الهيدروجيل ، والتحليل اللاحق عبر مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM). بعد إزالة الأنسجة ، يمكن أيضا تطبيق طرق الكيمياء المناعية والفحص المجهري الأخرى.
الغرض من هذا البروتوكول هو السماح بإلقاء نظرة على التنظيم في الموقع لخلايا P. aeruginosa في البلغم من مرضى التليف الكيسي. يجب تخزين عينات البلغم عند 4 درجات مئوية حتى تتم معالجتها إذا تعذر إصلاحها على الفور. لقد ثبت أن أعداد خلايا P. aeruginosa في البلغم لا تتغير بشكل كبير إذا تمت معالجتها في 1…
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن يشكروا مؤسسة التليف الكيسي التي قدمت التمويل لهذا البحث و MedImmune لتبرعهم السخي بالأجسام المضادة ل Psl0096. تم إجراء التصوير لهذه الدراسة في منشأة التصوير CAMiLoD في جامعة تورنتو.
29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
HistoDenz | Sigma | D2158 | |
Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
PseaerA – GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |