嚢胞性線維症患者の喀痰中の 緑膿菌 の可視化

本研究では、小児嚢胞性線維症(CF)患者の喀痰中の緑膿菌のin vivo構造を可視化する実験が設計されました。緑膿菌感染症は、小児CF人口の30〜40%で慢性化します。慢性感染症が確立されると、それらを排除することはほとんど不可能です¹.緑膿菌の早期感染患者から分離された緑膿菌株は、一般的に抗菌薬の影響を受けやすいため、^{慢性感染症の}確立を防ぐために抗シュードモナル抗生物質で治療されます2。残念ながら、すべての緑膿菌分離株が抗生物質療法後に肺から効果的に除去されるわけではありません。抗生物質の失敗に関連する正確なメカニズムは完全には解明されていません。これまでの研究では、バイオフィルム細胞の密度、凝集、多糖類産生のばらつきが抗生物質の有効性に影響を与える可能性があることが示されています³。緑膿菌は、Pel、Psl、アル^ギン酸の3つの細胞外多糖類を産生します4。緑膿菌のほとんどの菌株は、それぞれのエキソ多糖類を発現する遺伝的能力を持っていますが、多くの場合、1種類の多糖類が主に発現しています⁵。アルギン酸エキソ多糖類は、CF肺の慢性感染症と関連しており、ムコイド表現型^6,7をもたらします。多糖類のPelとPslは、初期接着の補助やバイオフィルム構造の維持、抗生物質耐性の付与など、複数の機能を持っています⁸。

組織のin vivo構造を可視化することを目的とした方法は、さまざまなサンプルタイプに対して開発されています^9,10,11。最近では、CF患者の喀痰中のin vivo微生物群集を視覚化するように調整されています¹²。喀痰内の微生物群集の同定に特化した組織透明化プロトコルの最適化は、DePas et al., 2016¹²によって開発されました。MiPACTという用語は、Passive CLARITY techniqueの後にmicrobial identificationの略で、CF痰^11,12の除去のために造られました。組織透明化技術では、標本は最初に固定され、次に透明化され、染色と顕微鏡的視覚化のために固有の構造をそのまま残します¹¹。CF喀痰サンプルを固定・除去することで、バイオフィルム構造、細菌細胞密度、多微生物との関連、病原体と宿主細胞との関連に関する疑問に答えることができます。喀痰内に保存された細菌を直接調べる利点は、宿主特異的な状況で分析・可視化できることです。実験のために実験室で臨床分離株をin vitroで増殖させることは非常に有益ですが、そのような方法ではCF肺環境を完全に再現することができず、その結果、検査結果と患者の転帰の間に乖離が生じます。

ここで紹介する方法は、CF患者や他の呼吸器感染症の患者からの細菌を視覚化するために、喀痰を固定および除去するために使用できます。本明細書に記載の染色および顕微鏡分析の特定のタイプは、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)であり、続いてハイドロゲル内での抗Psl抗体結合、およびその後の共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)による分析である。組織透明化に続いて、他の免疫組織化学および顕微鏡検査法も適用できます。