הדמיה של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס
概要
פרוטוקול זה מספק שיטות להדמיה של תאי חיידקים ורב-סוכר סינתזת רב-סוכר (Psl) בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס.
Abstract
גילוי מוקדם ומיגור של Pseudomonas aeruginosa בריאות של חולי סיסטיק פיברוזיס יכול להפחית את הסיכוי לפתח זיהום כרוני. התפתחות זיהומים כרוניים של P. aeruginosa קשורה לירידה בתפקוד הריאות ולעלייה בתחלואה. לכן, יש עניין רב להבהיר את הסיבות לכישלון למגר P. aeruginosa עם טיפול אנטיביוטי המתרחשת בכ 10-40% מהחולים ילדים. אחד הגורמים הרבים שיכולים להשפיע על פינוי הפונדקאי של P. aeruginosa ורגישות לאנטיביוטיקה הוא שינויים בארגון המרחבי (כגון צבירה או היווצרות ביופילם) וייצור פוליסכרידים. לכן, היינו מעוניינים לדמיין את המאפיינים באתרו של P. aeruginosa בתוך כיח של חולי CF. טכניקת ניקוי רקמות יושמה על דגימות כיח לאחר הטמעת הדגימות במטריצת הידרוג’ל כדי לשמור על המבנים התלת-ממדיים ביחס לתאים המארחים. לאחר ניקוי הרקמות, נוספו תוויות פלואורסצנטיות וצבעים כדי לאפשר הדמיה. הכלאה פלואורסצנטית באתרו בוצעה לצורך הדמיה של תאי חיידקים, קשירה של נוגדנים אנטי-PSL המסומנים באופן פלואורסצנטי להדמיה של האקסופוליסכריד וצביעה DAPI כדי להכתים תאים מארחים כדי לקבל תובנה מבנית. שיטות אלה אפשרו הדמיה ברזולוציה גבוהה של P. aeruginosa בתוך כיח של חולי CF באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.
Introduction
במחקר זה, ניסויים תוכננו כדי לדמיין את המבנה in vivo של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס ילדים (CF). זיהומים P. aeruginosa הופך כרוני ב 30-40% מאוכלוסיית CF ילדים; ברגע זיהומים כרוניים להתבסס, הם כמעט בלתי אפשרי לחסל1. P. aeruginosa מבודד מחולים עם זיהום מוקדם הם בדרך כלל רגישים יותר מיקרוביאלית, ולכן, אלה מטופלים עם אנטיביוטיקה אנטי pseudomonal כדי למנוע הקמת זיהום כרוני2. למרבה הצער, לא כל המבודדים של P. aeruginosa מנוקים ביעילות מהריאה לאחר טיפול אנטיביוטי. המנגנונים המדויקים הקשורים לכשל אנטיביוטי לא הובהרו במלואם. מחקרים קודמים הראו כי שינויים בצפיפות תאי ביופילם, צבירה וייצור רב-סוכר יכולים להשפיע על יעילות אנטיביוטיקה3. P. aeruginosa מייצר שלושה רב-סוכרים חוץ-תאיים: Pel, Psl ו-alginate4. לרוב הזנים של P. aeruginosa יש את היכולת הגנטית לבטא כל אחד מהאקסופוליסכרידים, אם כי לעתים קרובות סוג אחד של פוליסכריד מבוטא בעיקר5. אלגינט exopolysaccharide קשור לזיהומים כרוניים בריאה CF, וכתוצאה מכך פנוטיפ רירית 6,7. לרב-סוכרים Pel ו-Psl תפקידים רבים, כולל סיוע בהתקשרות ראשונית ושמירה על מבנה הביופילם, והענקת עמידות לאנטיביוטיקה8.
שיטות שמטרתן לדמיין מבנים in vivo של רקמות פותחו עבור מגוון רחב של סוגי מדגם 9,10,11. לאחרונה, הם הותאמו כדי לדמיין קהילות מיקרוביאליות in vivo בתוך כיח מחולי CF12. אופטימיזציה של פרוטוקול ניקוי רקמות במיוחד לזיהוי קהילות מיקרוביאליות בתוך כיח פותחה על ידי DePas et al., 201612. המונח MiPACT, ראשי תיבות של microbial identification after Passive CLARITY technique, נטבע לניקוי כיח CF11,12. עבור טכניקות ניקוי רקמות, הדגימות מתוקנות תחילה, ולאחר מכן הופכות לשקופות תוך השארת הארכיטקטורה הטבועה בהן ללא פגע לצורך צביעה והדמיה מיקרוסקופית11. תיקון וניקוי דגימות כיח CF מאפשרים לחוקרים לענות על שאלות הקשורות למבנה הביופילם, צפיפות תאי חיידקים, קשרים רב-מיקרוביאליים וקשרים בין פתוגנים לתאים מארחים. היתרון של בחינה ישירה של חיידקים שנשתמרו בתוך הכיח הוא שניתן לנתח אותם ולדמיין אותם בהקשר ספציפי למארח. למרות שגידול חוץ גופי של מבודדים קליניים במעבדה לניסויים יכול להיות אינפורמטיבי מאוד, שיטות כאלה אינן מסוגלות לשחזר באופן מלא את סביבת הריאות של CF, וכתוצאה מכך נוצר נתק בין תוצאות המעבדה לבין תוצאות המטופלים.
ניתן להשתמש בשיטות המוצגות כאן כדי לתקן ולנקות כיח כדי לדמיין חיידקים, בין אם מחולי CF או חולים עם זיהומים אחרים בדרכי הנשימה. הסוג הספציפי של צביעה וניתוח מיקרוסקופי המתואר כאן הוא הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH), ואחריה קשירת נוגדנים נגד PSL בתוך ההידרוג’ל, וניתוח עוקב באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM). לאחר ניקוי רקמות, ניתן ליישם גם שיטות אחרות של אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר הצצה לארגון באתרו של תאי P. aeruginosa בכיח מחולי CF. דגימות כיח יש לאחסן ב 4 ° C עד עיבוד אם הם לא יכולים להיות קבועים מיד. הוכח כי מספרי תאי P. aeruginosa בכיח אינם משתנים באופן משמעותי אם הם מעובדים ב 1 שעות, 24 שעות, או 48 שעות, כאשר מאוחסנים ב 4 ° C, אם כי אם נשאר ב 25 ° C במשך…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לקרן סיסטיק פיברוזיס שסיפקה מימון למחקר זה ול-MedImmune על תרומתם הנדיבה של נוגדנים נגד PSL0096. לצורך מחקר זה בוצעה הדמיה במתקן הדמיה CAMiLoD באוניברסיטת טורונטו.
Materials
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA – GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
参考文献
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Billings, N., et al. The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).
- Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl. Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).
- Wozniak, D. J., et al. Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 1-11 (2016).
- Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis. Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).
- Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. Induced sputum: Time from expectoration to processing. European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
- St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).
- Hogardt, M., et al. Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).
- Hoffmann, N., et al. Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis. Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).
- Nair, B., et al. Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).
- Howlin, R. P., et al. Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis. Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).
- Pestrak, M. J., et al. Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).
