낭포성 섬유증 환자의 객담 내 녹농균의 시각화
概要
이 프로토콜은 낭포성 섬유증 환자의 객담 내에서 박테리아 세포 및 다당류 합성 위치(Psl) 다당류의 시각화 방법을 제공합니다.
Abstract
낭포성 섬유증 환자의 폐 내에서 녹농균을 조기에 발견하고 근절하면 만성 감염 발병 가능성을 줄일 수 있습니다. 만성 녹농균 감염의 발병은 폐 기능 저하 및 이환율 증가와 관련이 있습니다. 따라서 소아 환자의 약 10-40%에서 발생하는 항생제 요법으로 녹농균을 근절하지 못하는 이유를 밝히는 데 큰 관심이 있습니다. 녹농균(P. aeruginosa)의 숙주 청소율과 항생제 감수성에 영향을 미칠 수 있는 많은 요인 중 하나는 공간 조직(예: 응집 또는 생물막 형성) 및 다당류 생산의 변화입니다. 따라서 CF 환자의 객담 내에서 녹농균의 현장 특성을 시각화하는 데 관심이 있었습니다. 숙주 세포에 대한 3D 구조를 유지하기 위해 샘플을 하이드로겔 매트릭스에 삽입한 후 객담 샘플에 조직 투명화 기술을 적용했습니다. 조직 투명화 후 형광 라벨과 염료를 추가하여 시각화를 가능하게 했습니다. 박테리아 세포의 시각화를 위해 형광 in situ 교잡화를 수행하고, 외다당류의 시각화를 위해 형광 표지된 항-PSL 항체의 결합을 수행하고, 구조적 통찰력을 얻기 위해 숙주 세포를 염색하기 위한 DAPI 염색을 수행했습니다. 이러한 방법을 통해 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 통해 CF 환자의 객담 내 녹농균의 고해상도 이미징을 수행할 수 있었습니다.
Introduction
이 연구에서 실험은 소아 낭포성 섬유증(CF) 환자의 객담 내에서 녹농균의 생체 내 구조를 시각화하도록 설계되었습니다. 녹농균 감염은 소아 CF 인구의 30-40%에서 만성화됩니다. 만성 감염이 발생하면 제거가 거의 불가능합니다1. 녹농균은 일반적으로 항균제에 더 취약하기 때문에 만성 감염을 예방하기 위해 항슈도몬 항생제로 치료한다2. 안타깝게도, 모든 녹농균 분리가 항생제 치료 후 폐에서 효과적으로 제거되는 것은 아닙니다. 항생제 실패와 관련된 정확한 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이전 연구에서는 생물막 세포 밀도, 응집 및 다당류 생산의 변화가 항생제 효능에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었습니다3. 녹농균(P. aeruginosa)은 펠(Pel), 피슬(Psl), 알긴산(alginate)의 세 가지 세포외 다당류를 생산합니다4. 녹농균(P. aeruginosa)의 대부분의 균주는 각 외다당류를 발현할 수 있는 유전적 능력을 가지고 있지만, 종종 한 종류의 다당류가 주로 발현된다5. 엑소다당류 알긴산은 CF 폐의 만성 감염과 관련이 있으며, 점액성 표현형 6,7을 초래합니다. 다당류 Pel과 Psl은 초기 부착 및 생물막 구조 유지를 돕고 항생제 내성을 부여하는 등 여러 기능을 가지고 있습니다8.
조직의 생체 내 구조를 시각화하는 것을 목표로 하는 방법은 다양한 샘플 유형 9,10,11에 대해 개발되었습니다. 최근에는 CF 환자의 객담 내 생체 내 미생물 군집을 시각화하도록 맞춤화되었습니다12. 객담 내 미생물 군집 식별을 위한 조직 투명화 프로토콜의 최적화는 DePas et al., 201612에 의해 개발되었습니다. Pa ssive CLARITY technique 이후 microbial identification의 약자인 MiPACT라는 용어는 CF 가래11,12의 제거를 위해 만들어졌습니다. 조직 투명화 기법의 경우, 표본을 먼저 고정한 다음 투명하게 렌더링하면서 염색 및 현미경 시각화를 위해 고유한 구조를 그대로 유지합니다11. CF 객담 샘플을 고정하고 투명화하면 생물막 구조, 박테리아 세포 밀도, 다균 결합, 병원체와 숙주 세포 간의 연관성과 관련된 질문에 답할 수 있습니다. 객담 내에 보존된 박테리아를 직접 검사하는 것의 장점은 숙주별 맥락에서 분석하고 시각화할 수 있다는 것입니다. 실험을 위해 실험실에서 임상 분리체의 체외 성장은 매우 유익할 수 있지만, 이러한 방법은 CF 폐 환경을 완전히 재현할 수 없으므로 실험실 결과와 환자 결과 사이에 단절이 발생합니다.
여기에 제시된 방법은 CF 환자나 다른 호흡기 감염 환자의 박테리아를 시각화하기 위해 객담을 고정하고 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 본 명세서에 기술된 염색 및 현미경 분석의 특정 유형은 형광 in situ hybridization(FISH), 하이드로겔 내 항-PSL 항체 결합, 그리고 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 통한 후속 분석이다. 조직 투명화 후 다른 면역조직화학 및 현미경 검사법도 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 목적은 CF 환자의 객담에서 녹농균 세포의 현장 조직을 엿볼 수 있도록 하는 것입니다. 객담 샘플은 즉시 고정할 수 없는 경우 처리할 때까지 4°C에서 보관해야 합니다. 객담 내 녹농균(P. aeruginosa) 세포 수는 4°C에서 보관할 때 1시간, 24시간 또는 48시간에 처리하면 크게 변하지 않지만, 25°C에서 24시간 또는 48시간 동안 방치하면 박테리아 성장의 결과로 박테리아 세포 수…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 이 연구에 자금을 지원한 낭포성 섬유증 재단(Cystic Fibrosis Foundation)과 항-Psl0096 항체를 아낌없이 기증한 MedImmune에 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구를 위해 이미징은 토론토 대학의 CAMiLoD 이미징 시설에서 수행되었습니다.
Materials
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA – GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
参考文献
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