בידוד גרעיני בודד מסתמך על חדירות הדיסוציאציה וחומרי הניקוי המבוססים על קרום התא, צעדים הזקוקים לאופטימיזציה ונוטים להציג חפצים טכניים. אנו מדגימים כביסה ופרוטוקול ללא אנזים לבידוד מהיר של גרעינים שלמים ישירות מרקמות שלמות, מניב גרעינים מתאים לגרעין בודד RNA-seq (snRNA-Seq) או ATAC-seq.
תפוקה גבוהה להמרה ופרופיל אפיגנום דורש הכנה של תא יחיד או השעיית גרעין יחיד. הכנת ההשעיה עם תא או גרעינים שלמים כרוכה בדיסוציאציה ובחדירות, צעדים שיכולים להציג רעש לא רצוי ונזק בלתי רצוי. במיוחד, סוג תא מסוימים כגון נוירונים הם מאתגרת לנתק לתוך תאים בודדים. בנוסף, החדירות של הקרום התאי כדי לשחרר גרעינים דורש אופטימיזציה על ידי ניסוי ושגיאה, אשר יכול להיות זמן רב, עבודה אינטנסיבית ומבחינה כספית לא קיימא. כדי לשפר את החוסן ואת הגישה של הכנה לדוגמה עבור רצף תפוקה גבוהה, אנו מתארים אנזים מהיר ונטול כביסה בידוד גרעיני שיטת הבידוד. הפרוטוקול מאפשר בידוד יעיל של גרעינים מן המוח כולו דג בתוך 20 דקות. גרעין מבודד להציג מורפולוגיה גרעינית שלמים ונטייה נמוכה לצבור. יתר על כן, הזרימה cy, לנסות מאפשר העשרה גרעינים והרשאה של פסולת תאית עבור יישום במורד הזרם. הפרוטוקול, אשר צריך לעבוד על רקמות רכות ותאים מתורבתים, מספק שיטה פשוטה ונגישה עבור הכנה לדוגמה שניתן לשימוש עבור פרופיל תפוקה גבוהה, פישוט השלבים הדרושים עבור מוצלח של גרעין יחיד RNA-seq ו-ATAC-seq ניסויים.
תא בודד RNA-seq (scRNA-Seq) ו-ATAC-seq הם כלי רב-תכליתי לחקר מערכות ביולוגיות מורכבות ברזולוציה של תא בודד. הם מנוצלים באופן נרחב כדי להגדיר תת תאים ומדינות, רשתות גנים כדי להעריך טרוגניות הסלולר. תנאי מוקדם לביצוע scRNA-seq הוא הכנת תא השעיה בודד על ידי הדיסוציאציה של רקמת. בשל הווריאציה של הרכב מטריצה החילוץ ותכונות מכניות, רקמות בודדות דורשות אופטימיזציה של פרוטוקול הדיסוציאציה להכנת השעיית תא בודד.
דיסוציאציה של רקמות לתוך תאים בודדים בדרך כלל כרוך טיפול עם אנזימי העיכול, כולל קולגן, dispase או טריפסין, ב 37 ° c1,2,3,4. כאשר המכונות הטרסטיות נשארות פעילות ב-37 ° c, הדיסוציאציה האנזימטית יכולה להציג את הממצאים של mrna ביטוי ורעש5,6. בעיקר, דגירה ממושכת יכול לגרום למתח התגובה הגנים ותגובת הלם חום באופן לא אחיד-המוביל לשונות טכנית בניסוי7.
עוד חיסרון של יצירת תא הבולם היחיד הוא הקושי להשיג תאים ושלמים של מסוג תא עם מורפולוגיות מורכבות. בפרט, נוירונים, אדיפוציטים ופודוקציטים מאתגרים לבודד8,9,10,11. למשל, וו ועמיתיו הפגינו העדר פודוקציטים בscRNA פרופילים של כלייה של עכבר למבוגרים12. מתצפיות דומות שאינן אופטימליות נעשו בנוגע להתאוששות של נוירונים מחוברים מרקמת8המוח 8,13,14. בסיכום, פרוטוקולי דיסוציאציה יכולים להחדיר הטיית זיהוי לכיוון קל יותר לנתק סוגי תאים, המובילים לייצוג מוטעה של הארכיטקטורה התאית של האיבר.
כדי להתגבר על רעש טכני הטיה הציג במהלך הכנת לדוגמה ב-scRNA-Seq., בידוד ופרופיל הגרעין מספק חלופה אטרקטיבית. כמו מורפולוגיה גרעינית דומה בין סוגי תאים שונים, בידוד של גרעינים להקיף את הנושא של בידוד תאים שלמים וקיימא עם מורפולוגיות מורכבים. למשל, וו ועמיתיו הפגינו פרופיל מוצלח של podocytes הפקעיות עם גרעין יחיד RNA-Seq. (snRNA-Seq.) של כליה עכבר למבוגרים, אשר היה חסר scRNA-Seq12. שליט, מחקרים השוואתיים בין תא יחיד ו-בודד בגרעין RNA-seq הציעו ירידה האינדוקציה של מתח והחום התגובה גנים עם snRNA-Seq12. המחקרים נוספים מצביעים על קורלציה גבוהה בין הגנים המזוהים בשתי השיטות. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה על מיקרוגלייה האדם נכשל לזהות הפעלה גנטית במחלת האלצהיימר15. כך בהקשרים מסוימים, snrna-Seq הוא חלופה מתאימה עבור scRNA-seq16,17. בנוסף, הבידוד הגרעיני יכול להיות מנוצל עבור תא יחיד ATAC-Seq., מתן מידע על האזורים של כרומטין פתוח בתוך תאים בודדים.
הפרוטוקול עבור בידוד גרעינים כולל שלושה שלבים עיקריים: i) מבוסס על אבקת כביסה של קרום התא כדי לשחרר את הגרעין; ii) רקמת הומוגון באמצעות מכשיר הומוגניזה; ו iii) העשרת גרעינים והסרת פסולת תא באמצעות הדרגתי צנטריפוגה או זרימה cy try18,19,20,21,22. בין השאר, שני השלבים הראשונים תלויים בסוג הרקמה וצריכים להיות ממוטבים באופן אמפירי. תכשיר ניקוי מתון מוביל לקרע חלקי של קרום התא ולאחזור לא יעיל של גרעינים מרקמת23. מצד שני, רמה גבוהה של חומרי ניקוי והומוגון קשה מוביל לקרע בקרום הגרעיני ולאבדן שלהם24,25. גרעיני מקרע נוטים להתאחד וליצור אגרגטים, אשר אם לא יוסרו יכול להוביל לחפצים בניסוי הפרופיל במורד הזרם.
כדי לעקוף את הבעיות הקשורות לאופטימיזציה של חומרי ניקוי עבור בידוד גרעינים, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד גרעינים שלמים מדגימות טריות באמצעות שיטה נטולת כבלי ניקוי ומבוססת-עמודה. הפרוטוקול מניב גרעינים מאיבר שלם בתוך 20 דקות, ומגביל את האינדוקציה של התמלול העובדתי. גרעיני מבודד יכול להיות מועשר עם FACS עבור גרעין יחיד RNA-Seq. ו-ATAC-seq, מתן שיטה פשוטה ואוניברסלית המאפשרת פרופיל תפוקה גבוהה וללא החזקה.
יצירת פרופיל הטרנססקריפט ואפיגנום ברזולוציה של תא בודד יש מהפכה במחקר של מערכות ביולוגיות. מחקרים ברזולוציה של תא בודד לרקמה מוצקה תלויות בדיסוציאציה של האיבר לתאים בודדים או לגרעינים. דיסוציאציה היא הליך הרסני שיכול להציג ממצאים טכניים, אשר יכולים למנוע פיתוח של ייצוג מדויק של המערכת5,6. למשל, הדיסוציאציה האנזימטית יכולה לפגוע בתאים עם מורפולוגיות מורכבות, כגון נוירונים או פודוקציטים, ויכולים לגרום לביטוי למתח ולתגובה בהלם חום גנים7,12. בנוסף, שימוש בתכשיר ניקוי במהלך הדיסוציאציה יכול לקרוע את הקרום הגרעיני ולהוביל לצבירה23,25. לפיכך, אופטימיזציה של הדיסוציאציה להשגת תא בודד או השעיית גרעינים באיכות הגבוהה ביותר היא החשובה ביותר להצלחה של ניסויים בתפוקה גבוהה של פרופילים.
כאן, אנו מדגימים שיטת ניקוי ובידוד גרעיני האנזים מאפשר חילוץ של גרעינים שלמים ממוח דג זברה בתוך פחות מ 20 דקות. הפרוטוקול מניב גרעינים עם מורפולוגיה טיפוסית ושלמות איתנה (איור 2). ממוח בודד דג זברה במשקל 6 מ ג, הפרוטוקול מניב סך של 60,000 גרעינים הנקבעים על ידי ספירת הומוציטוטומטר. גרעיני מבודד יכול להיות מנוצל עבור יישומים מרובים במורד, כולל snRNA-seq, ATAC-seq ו חיסוני. הגרעין המבודד עשוי לכלול מזהמים משברים cytoplasmic, במיוחד מרכיבים של רשתית העין והמיטומינציה. מומלץ מאוד לערוך ניסויים ביצירת פרופילים בעלי תפוקה גבוהה, סיווג של פסולת תאית, בעיקר מיטוכונמיטוa. Cy,באיור 3, מספק אפשרות מעשית לטיהור גרעינים. לחילופין, מעבר שיפוע הסוכות יכול להיות מנוצל גם לסילוק פסולת.
הפרוטוקול נבדק על בלוטת התריס העכבר (נתונים לא מוצגים) ומספק תוצאות בדומה לרקמת המוח דג זברה. בסך הכל, הפרוטוקול מספק שיטה איתנה, מסייעת ואוניברסלית להכנת השעיית גרעין יחיד, המסייעת לפשט את הלוגיסטיקה לניסויים ביצירת פרופילים בעלי תפוקה גבוהה.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברי מעבדת ד ר סבין קוסטלייולה וסינג על הערות על כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי כפות העור דה לה רצ’רצ’ה-FNRS תחת מספר 34772792 – MISU ל S.P.S.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |