Tek çekirdek izolasyonu ayrışma ve hücre zarının deterjan bazlı permeabilizasyonuna, optimizasyona ihtiyaç duyan ve teknik eserlere yatkın adımlara dayanır. Tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-Seq) veya ATAC-seq için uygun olan çekirdekleri doğrudan tüm dokudan hızlı bir şekilde izole etmek için deterjan ve enzimsiz bir protokol gösteriyoruz.
Yüksek iş itimattransom ve epigenom profilleme tek bir hücre veya tek çekirdek süspansiyon hazırlanması nı gerektirir. Bozulmamış hücre veya çekirdekile süspansiyon hazırlanması ayrışma ve permeabilizasyon, istenmeyen gürültü ve istenmeyen hasara neden olabilir adımlar içerir. Özellikle, nöronlar gibi bazı hücre tipleri bireysel hücrelere ayrıştırmak için zor. Ayrıca, hücre zarının çekirdekleri serbest bırakmak için permeabilizasyonu deneme yanılma ile optimizasyon gerektirir, hangi zaman alıcı olabilir, emek yoğun ve mali açıdan cansız. Yüksek iş letim atabilen numune hazırlamanın sağlamlığını ve tekrarlanabilirliğini artırmak için hızlı bir enzim ve deterjansız kolon bazlı çekirdek izolasyon yöntemini tanımlıyoruz. Protokol, 20 dakika içinde tüm zebra balığı beyninden çekirdeklerin etkin bir şekilde izole edilmesini sağlar. İzole çekirdekleri bozulmamış nükleer morfoloji ve agrega düşük eğilimi görüntüler. Ayrıca, akış sitometri çekirdekleri zenginleştirme ve downstream uygulama için hücresel enkaz temizliği sağlar. Yumuşak dokular ve kültürlü hücreler üzerinde çalışması gereken protokol, başarılı tek çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq deneyleri için gerekli adımları basitleştirerek, yüksek iş yapma lı profilleme için kullanılabilen numune hazırlama için basit ve erişilebilir bir yöntem sağlar.
Tek hücreli RNA-seq (scRNA-Seq) ve ATAC-seq, karmaşık biyolojik sistemleri tek hücreli çözünürlükte incelemek için çok yönlü araçlardır. Hücre alt tiplerini ve durumlarını, gen ağlarını tanımlamak ve hücresel heterojenliği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadırlar. ScRNA-seq yapmak için bir ön koşul doku dissosiyatasyonu ile tek hücreli süspansiyon hazırlanmasıdır. Hücre dışı matris bileşimi ve mekanik özelliklerindeki değişim nedeniyle, tek tek dokular tek hücreli süspansiyonun hazırlanması için ayrışma protokolünün optimizasyonunu gerektirir.
Tek hücrelere dokuların ayrışması genellikle 37 °C1,2,3,4de, kollajenaz, dispase veya tripsin gibi sindirim enzimleri ile tedavi içerir. Transkripsiyonel makineler 37 °C’de aktif kaldığından, enzimatik dissosilasyon mRNA ekspresyonu eserlerini ve gürültüyü5,6olarak tanıtabilir. Özellikle, uzun süreli kuluçka strese duyarlı genler ve tekdüze olmayan bir şekilde ısı şoku yanıtı neden olabilir – deneyde teknik değişkenlik yol7.
Tek bir hücre süspansiyon uyaratmanın bir diğer dezavantajı da karmaşık morfolojilere sahip canlı ve sağlam hücre tiplerini elde etmedeki zorlukdur. Özellikle, nöronlar, adipositler ve podositler,8,9,10,11izole etmek için zor . Örneğin, Wu ve meslektaşları bir yetişkin fare böbrek12scRNA profilleriglomerüler podositlerin eksikliği gösterdi. Benzer optimal olmayan gözlemler beyin dokusundan birbirine bağlı nöronların kurtarma ile ilgili yapılmıştır8,13,14. Özetle, ayrışma protokolleri hücre tiplerini daha kolay ayrıştırmaya yönelik algılama önyargısı getirebilmekte ve bu da organın hücresel mimarisinin yanlış yorumlanmasına yol açabilmektedir.
ScRNA-Seq.’de numune hazırlama sırasında ortaya çıkan teknik gürültü ve önyargının üstesinden gelmek için, çekirdeğin izolasyonu ve profilinin saptanması cazip bir alternatif sunar. Nükleer morfoloji farklı hücre tipleri arasında benzer olduğundan, çekirdeklerin izolasyonkarmaşık morfolojileri ile bozulmamış ve canlı hücreleri izole sorunu atlatır. Örneğin, Wu ve meslektaşları tek çekirdekli RNA-Seq ile glomerüler podositler başarılı profilleme gösterdi (snRNA-Seq.) bir yetişkin fare böbrek, hangi scRNA-Seq12eksikti . İlginçtir, tek hücreli ve tek çekirdekli RNA-seq arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar snRNA-Seq12ile stres ve ısı şoku yanıt genlerinin indüksiyon bir azalma önerdi. Çalışmalar ayrıca iki yöntem tarafından saptanır genler arasında yüksek bir korelasyon göstermektedir. Ancak, insan mikroglia üzerinde yapılan yeni bir çalışmada Alzheimer hastalığında genetik aktivasyonu tespit etmek için başarısız oldu15. Böylece belirli bağlamlarda, snRNA-Seq scRNA-Seq16,17için uygun bir alternatiftir. Ayrıca, nükleer izolasyon tek hücreli ATAC-Seq için kullanılabilir., tek tek hücreler içinde açık kromatin bölgeleri hakkında bilgi sağlayan.
Çekirdek izolasyonu protokolü üç ana adımı içerir: i) hücre zarının çekirdeği serbest bırakmak için deterjan bazlı lysis; ii) bir Dounce homogenizer kullanarak doku homojenizasyonu; ve iii) çekirdeklerin zenginleşmesi ve degrade santrifüj,19,20,veya akış sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri kullanarak hücre enkaz kaldırma , 21,1822.22 Bu, ilk iki adım doku tipine bağlıdır ve ampirik optimize edilmesi gerekir. Hafif deterjan hücre zarının kısmi rüptürüne ve nükleusların dokudan verimsiz alınmasına yol açar23. Öte yandan, deterjan ve sert homojenizasyon yüksek düzeyde nükleer membran rüptürü ve kaybı yol açar24,25. Yırtılmış çekirdekler daha da bir araya kümelenme eğilimindedir ve kaldırılmazsa aşağı profilleme deneyinde eserlere yol açabilir agregalar oluşturur.
Çekirdek izolasyonu için deterjan optimizasyonu ile ilgili sorunları atlatmak için, bozulmamış çekirdekleri deterjansız ve spin-kolon tabanlı bir yöntem kullanarak taze numunelerden izole etmek için bir protokol uyguluyoruz. Protokol, tüm organdan çekirdekleri 20 dakika içinde verir ve bu da transkripsiyonun indüksiyonunu sınırlar. İzole çekirdekler, tek çekirdekli RNA-Seq. ve ATAC-seq için FACS ile zenginleştirilebilir ve sağlam ve çoğaltılabilir yüksek iş lenme profili oluşturmayı sağlayan basit ve evrensel bir yöntem sağlar.
Transkriptom ve epigenomun tek hücreli çözünürlükte profilini çıkarmak biyolojik sistemlerin incelenmesinde devrim yarattı. Katı bir doku için tek bir hücrenin çözünürlüğünde yapılan çalışmalar, organın tek tek hücrelere veya çekirdeklere ayrıştırılmasına bağlıdır. Dissosyon, sistemin 55, 6’nın6doğru bir temsilinin geliştirilmesini engelleyebilen teknik eserler idamı veren yıkıcı bir prosedürdür. Örneğin, enzimatik dissociation karmaşık morfolojileri ile hücrelere zarar verebilir, nöronlar veya podositler gibi, ve stres ve ısı şoku yanıt genlerinin ifade neden olabilir7,12. Ayrıca, dissosilasyon sırasında deterjan kullanımı nükleer membran yırtılması ve toplama yol açabilir23,25. Bu nedenle, tek bir hücre veya en yüksek kalitede çekirdek süspansiyon elde etmek için ayrışma optimize yüksek iş çıkışlı profilleme deneylerin başarısı için çok önemlidir.
Burada, zebra balığı beyninden bozulmamış çekirdeklerin 20 dakikadan daha kısa bir sürede çıkarılmasını sağlayan bir deterjan ve enzimsiz çekirdek izolasyon yöntemi gösteriyoruz. Protokol tipik morfolojisi ve sağlam bütünlüğü ile çekirdekleri verir(Şekil 2). 6 mg ağırlığındaki tek bir zebra balığı beyninden, protokol hemositometre sayısı ile belirlenen toplam 60.000 çekirdek verir. İzole çekirdekleri snRNA-seq, ATAC-seq ve immünboyama dahil olmak üzere birden fazla downstream uygulamaları için kullanılabilir. İzole çekirdekleri sitoplazmik fraksiyonlardan çapraz kontaminasyon içerebilir, özellikle endoplazmik retikulum ve mitokondri bileşenleri. Yüksek iş bölümü profilleme deneyleri için, hücresel enkazın, özellikle mitokondrilerin temizlenmesi şiddetle tavsiye edilir. Akış sitometrisi (Şekil 3) çekirdeklerin saflaştırılması için uygun bir seçenek sağlar. Alternatif olarak, sakaroz gradyanı da enkaz kaldırılması için kullanılabilir.
Protokol fare tiroid bezi üzerinde test edilmiştir (veriler gösterilmez) ve zebra balığı beyin dokusuna benzer sonuçlar sağlar. Genel olarak, protokol tek çekirdek süspansiyonu hazırlanması için sağlam, tekrarlanabilir ve evrensel bir yöntem sağlayarak yüksek iş çıkarma lı profil oluşturma deneyleri için lojistiği basitleştirmeye yardımcı olur.
The authors have nothing to disclose.
Dr. Sabine Costagliola ve Singh laboratuarı üyelerine el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS tarafından 34772792 – MISU’dan S.P.S.’ye hibe numarası altında desteklenmiştir.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |