L’isolamento dei nuclei singoli si basa sulla dissociazione e sulla permeabilizzazione a base di detersivo della membrana cellulare, passaggi che necessitano di ottimizzazione e soggetti a introdurre artefatti tecnici. Dimostriamo un protocollo detergente e privo di enzimi per un rapido isolamento dei nuclei intatti direttamente dall’intero tessuto, producendo nuclei adatti per singolo nucleo RNA-seq (snRNA-seq) o ATAC-seq.
Il trascrittoma ad alto contenuto di velocità e la profilazione dell’epigenoma richiedono la preparazione di una sospensione a singola cellula o a singolo nuclei. La preparazione della sospensione con cellule o nuclei intatti comporta la dissociazione e la permeabilizzazione, passaggi che possono introdurre rumore indesiderato e danni indesiderati. In particolare, alcuni tipi di cellule come i neuroni sono difficili da dissociare in singole cellule. Inoltre, la permeabilizzazione della membrana cellulare per rilasciare i nuclei richiede l’ottimizzazione da prova-ed-errore, che può richiedere tempo, lavoro intensivo e finanziariamente non vitale. Per migliorare la robustezza e la riproducibilità della preparazione dei campioni per il sequenziamento ad alto consumo, viene descritto un metodo di isolamento dei nuclei basati su colonne a colonne rapido e senza enzimi e detergenti. Il protocollo consente un efficiente isolamento dei nuclei dall’intero cervello del pesce zebra entro 20 minuti. I nuclei isolati mostrano una morfologia nucleare intatta e una bassa propensione all’aggregazione. Inoltre, la citometria di flusso consente l’arricchimento e l’autorizzazione dei nuclei dei detriti cellulari per l’applicazione a valle. Il protocollo, che dovrebbe funzionare su tessuti molli e cellule coltivate, fornisce un metodo semplice e accessibile per la preparazione dei campioni che può essere utilizzato per la profilazione ad alta velocità, semplificando le fasi necessarie per il successo di esperimenti di RNA-seq e ATAC-seq mono-nuclei.
RNA-seq unicellulare (scRNA-Seq) e ATAC-seq sono strumenti versatili per studiare sistemi biologici complessi a risoluzione cellulare singola. Sono ampiamente utilizzati per definire sottotipi e stati cellulari, reti geniche e per valutare l’eterogeneità cellulare. Un prerequisito per l’esecuzione di scRNA-seq è la preparazione di una sospensione a singola cellula mediante dissociazione tissutale. A causa della variazione nella composizione della matrice extracellulare e nelle proprietà meccaniche, i singoli tessuti richiedono l’ottimizzazione del protocollo di dissociazione per la preparazione della sospensione a cella singola.
La dissociazione dei tessuti in singole cellule prevede in genere il trattamento con enzimi digestivi, tra cui collagenasi, dispasi o trypsin, a 37 C1,2,2,4.4 Poiché le macchine trascrizionali rimangono attive a 37 gradi centigradi, la dissociazione enzimatica può introdurre artefatti di espressione mRNA e rumore5,6. In particolare, l’incubazione prolungata può indurre geni che rispondono allo stress e risposta agli shock termici in modo non uniforme, portando alla variabilità tecnica nell’esperimento7.
Un altro inconveniente di generare una sospensione a una singola cella è la difficoltà di ottenere tipi di cellule vitali e intatti con morfologie complesse. In particolare, neuroni, adipociti e podociti sono difficili da isolare8,9,10,11. Per esempio, Wu e colleghi hanno dimostrato l’assenza di podociti glomeriul nei profili scRNA da un rene di topo adulto12. Simili osservazioni non ottimali sono state fatte per quanto riguarda il recupero di neuroni interconnessi dal tessuto cerebrale8,13,14. In sintesi, i protocolli di dissociazione possono introdurre una distorsione di rilevamento verso più facile dissociare i tipi di cellule, portando a una falsa rappresentazione dell’architettura cellulare dell’organo.
Per superare il rumore tecnico e la distorsione introdotti durante la preparazione del campione in scRNA-Seq., l’isolamento e la profilazione del nucleo forniscono un’alternativa interessante. Poiché la morfologia nucleare è simile tra i diversi tipi di cellule, l’isolamento dei nuclei elude il problema dell’isolamento delle cellule intatte e vitali con morfologie complesse. Per esempio, Wu e colleghi hanno dimostrato di successo la profilazione dei podociti glomeriul con l’RNA-Seq. mononucleo (snRNA-Seq.) di un rene adulto di topo, che mancava da scRNA-Seq12. Intrigantemente, studi comparativi tra RNA-seq a cellula singola e nucleo singolo hanno suggerito una diminuzione dell’induzione di stress e geni di risposta agli shock termici con snRNA-Seq12. Gli studi suggeriscono inoltre un’elevata correlazione tra i geni rilevati dai due metodi. Tuttavia, un recente studio sulla microglia umana non è riuscito a rilevare l’attivazione genetica nella malattia di Alzheimer15. Così, in alcuni contesti, snRNA-Seq è un’alternativa adatta per scRNA-Seq16,17. Inoltre, l’isolamento nucleare può essere utilizzato per ATAC-Seq. a cella singola, fornendo informazioni sulle regioni della cromatina aperta all’interno delle singole cellule.
Il protocollo per l’isolamento dei nuclei prevede tre fasi principali: i) lisi a base di detergente della membrana cellulare per rilasciare il nucleo; ii) omogeneizzazione dei tessuti utilizzando un omogeneizzatore Dounce; e iii) arricchimento dei nuclei e la rimozione dei detriti cellulari utilizzando la centrifugazione sfumata o la citometria di flusso18,19,20,21,22. Tra questi, i primi due passaggi dipendono dal tipo di tessuto e devono essere ottimizzati empiricamente. Detergente delicato porta alla rottura parziale della membrana cellulare e recupero inefficiente dei nuclei dal tessuto23. D’altra parte, l’alto livello di detersivo e l’omogenesi dura porta alla rottura della membrana nucleare e la loro perdita24,25. I nuclei rotti tendono ulteriormente a raggrupparsi e a formare aggregati, che se non rimossi possono portare a artefatti nell’esperimento di profilazione a valle.
Per aggirare i problemi legati all’ottimizzazione del detersivo per l’isolamento dei nuclei, introduciamo un protocollo per isolare i nuclei intatti da campioni freschi utilizzando un metodo senza detersivo e basato su spin. Il protocollo fornisce nuclei da intero organo entro 20 minuti, limitando l’induzione della trascrizione artifactuali. I nuclei isolati possono essere arricchiti con FACS per singolo nuclei RNA-Seq. e ATAC-seq, fornendo un metodo semplice e universale che consente una profilazione robusta e riproducibile ad alta produttività.
La profilazione del trascrittoma e dell’epigenoma a una risoluzione unicellulare ha rivoluzionato lo studio dei sistemi biologici. Gli studi sulla risoluzione di una singola cellula per un tessuto solido dipendono dalla dissociazione dell’organo in singole cellule o nuclei. La dissociazione è una procedura distruttiva che può introdurre artefatti tecnici, che possono impedire lo sviluppo di una rappresentazione accurata del sistema5,6. Per esempio, la dissociazione enzimatica può danneggiare le cellule con morfologie complesse, come neuroni o podociti, e può indurre l’espressione di geni di stress e di risposta agli shock termici7,12. Inoltre, l’uso di detersivo durante la dissociazione può rompersi la membrana nucleare e portareall’aggregazione 23,25. Pertanto, ottimizzare la dissociazione per ottenere una singola cellula o la sospensione nucleiconda di altissima qualità è fondamentale per il successo degli esperimenti di profilazione ad alta produttività.
Qui, dimostriamo un metodo di isolamento dei nuclei detergenti e senza enzimi che consente l’estrazione di nuclei intatti dal cervello del pesce zebra in meno di 20 minuti. Il protocollo produce nuclei con morfologia tipica e robusta integrità (Figura 2). Da un singolo cervello di pesce zebra del peso di 6 mg, il protocollo produce un totale di 60.000 nuclei determinati da un conteggio di emocitometri. I nuclei isolati possono essere utilizzati per molteplici applicazioni a valle, tra cui snRNA-seq, ATAC-seq e immunostaining. I nuclei isolati possono includere la contaminazione incrociata da frazioni citoplasmiche, in particolare da componenti di reticolo endoplasmico e mitocondri. Per gli esperimenti di profilazione ad alto throughput, è fortemente raccomandata la distanza dei detriti cellulari, in particolare dei mitocondri. La citometria di flusso (Figura 3) fornisce un’opzione praticabile per la purificazione dei nuclei. In alternativa, il gradiente di saccarosio può essere utilizzato anche per la rimozione dei detriti.
Il protocollo è stato testato sulla ghiandola tiroidea del topo (dati non mostrati) e fornisce risultati simili al tessuto cerebrale del pesce zebra. Nel complesso, il protocollo fornisce un metodo robusto, riproducibile e universale per la preparazione di sospensioni a nucleo singolo, contribuendo a semplificare la logistica per esperimenti di profilazione ad alta produttività.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo i membri del laboratorio Dr. Sabine Costagliola e Singh per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS con il numero di sovvenzione 34772792 – MISU a S.P.S.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |