単核単離は、細胞膜の解離および洗剤ベースの透過性、最適化を必要とし、技術的なアーティファクトを導入する傾向があるステップに依存しています。我々は、単核RNA-seq(snRNA-Seq)またはATAC-seqに適した核を得て、組織全体から直接無傷核を迅速に単離するための洗浄剤および酵素フリープロトコルを実証する。
ハイスループットのトランスクリプトームおよびエピゲノムプロファイリングには、単一細胞または単一核懸濁液の調製が必要です。無傷の細胞または核を有する懸濁液の調製は、解離および透過性、望ましくない騒音および望ましくない損傷を引き起こす可能性のあるステップを伴う。特に、ニューロンなどの特定の細胞タイプは、個々の細胞への解き分けに挑戦しています。さらに、核を放出する細胞膜の透過性は試行錯誤による最適化を必要とし、時間がかかり、労働集約的で財政的に不可能である。ハイスループットシーケンシング用のサンプル調製の堅牢性と再現性を高めるために、迅速な酵素および洗浄剤を含まないカラムベースの核単離法について説明します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの脳全体から20分以内に核を効率的に分離することができます。単離核は、無傷の核形態と凝集する傾向が低い。さらに、フローサイトメトリーは、下流の適用のための細胞デブリの核濃縮およびクリアランスを可能にする。このプロトコルは、軟組織および培養細胞で動作する必要があり、高スループットプロファイリングに使用できるサンプル調製のための簡単でアクセス可能な方法を提供し、単核RNA-seqおよびATAC-seq実験を成功させるために必要なステップを簡素化します。
単細胞RNA-セク(scRNA-Seq)およびATAC-seqは、単一細胞分解能で複雑な生物学的システムを研究するための汎用性の高いツールです。これらは、細胞のサブタイプおよび状態、遺伝子ネットワークを定義し、細胞の不均一性を評価するために広く利用されています。scRNA-seqを行うための前提条件は、組織解離による単一細胞懸濁液の調製である。細胞外マトリックス組成および機械的特性のばらつきにより、個々の組織は単一細胞懸濁液の調製のための解離プロトコルの最適化を必要とする。
組織を単一細胞に解離することは典型的に、コラゲターゼ、ディスパーゼまたはトリプシンを含む消化酵素を37°C1、2、3、4で処理することを含1,2,3,む。転写機械は37°Cで活性を保つため、酵素解離はmRNA発現アーチファクトとノイズ5,6,6を導入する可能性がある。特に、長時間のインキュベーションは、ストレス応答性遺伝子と熱ショック応答を不均一な方法で誘導し、実験7における技術的な変動をもたらす。
単一の細胞懸濁液を生成するもう一つの欠点は、複雑な形態を有する生存可能かつ無傷の細胞型を得るのが難しい点である。特に、ニューロン、アディポサイト、およびポドサイトは、8、9、10、119,10,11を分離するのに挑戦しています。8例えば、Wuたちは、成人マウス腎臓12からのscRNAプロファイルにおける糸球体ポドサイトの欠如を実証した。,脳組織88,13,14からの相互接続ニューロンの回復に関して同様の非最適な観測がなされている。,1314要するに、解離プロトコルは、細胞タイプの解離が容易に向けて検出バイアスを導入し、器官の細胞アーキテクチャの虚偽表示につながる可能性がある。
scRNA-Seq.でサンプル調製中に導入された技術的なノイズとバイアスを克服するために、核の単離およびプロファイリングは魅力的な代替手段を提供する。核形態は異なる細胞タイプ間で類似しているので、核の単離は、複雑な形態を有する無傷で生存可能な細胞を単離する問題を回避する。例えば、Wuたちは、scRNA-Seq12から欠けていた成体マウス腎臓の単核RNA-Seq.(snRNA-Seq.)を有する糸球体ポドサイトのプロファイリングに成功したことを実証した。興味深いことに、単一細胞と単核RNA-seqの比較研究は、snRNA-Seq12を用いたストレスおよび熱ショック応答遺伝子の誘導の減少を示唆している。この研究は、この2つの方法で検出された遺伝子間の高い相関関係をさらに示唆している。しかし、ヒトミクログリアに関する最近の研究では、アルツハイマー病15における遺伝的活性化を検出できなかった。したがって、特定の文脈において、snRNA-SeqはscRNA-Seq16、17,17に適した代替手段である。さらに、核分離は単一細胞ATAC-Seq.に利用することができ、個々の細胞内のオープンクロマチンの領域に関する情報を提供する。
核単離のためのプロトコルは、3つの主要なステップを伴う:i)核を放出する細胞膜の洗浄剤ベースのリシス;ii) Dounceホモジナイザーを使用した組織均質化;iii)凝縮またはフローサイト,メトリー,18、19、20、21、22を使用して細胞18,19デブリの核および除去の濃縮。21,2220この中で、最初の2つのステップは組織タイプに依存し、経験的に最適化する必要があります。中性洗剤は、細胞膜の部分的な破裂と組織23からの核の非効率的な検索をもたらす。一方、高レベルの洗剤と粗均質化は、核膜の破裂とその損失24、25,を招く。破裂した核はさらに凝集して凝集体を形成する傾向があり、除去しなければ下流プロファイリング実験でアーティファクトを引き起こす可能性があります。
核単離用の洗浄剤最適化に関する問題を回避するために、洗剤を含まないスピンカラムベースの方法を用いて、新鮮なサンプルから無傷の核を分離するプロトコルを導入します。このプロトコルは、20分以内に全器官から核を生成し、実際の転写の誘導を制限する。単核RNA-Seq.およびATAC-seqのためのFACSとの単一核の濃縮が可能であり、堅牢で再現可能なハイスループットプロファイリングを可能にする、シンプルで普遍的な方法を提供する。
単一細胞分解能でトランスクリプトームとエピゲノムをプロファイリングすると、生物学的システムの研究に革命が起こった。固体組織に対する単一細胞の分解能の研究は、個々の細胞または核への器官の解離に依存する。解離は、技術的なアーティファクトを導入することができる破壊的な手順であり、システム55、66の正確な表現の開発を妨げる可能性があります。例えば、酵素解離は、ニューロンやポドサイトなどの複雑な形態を有する細胞に害を及ぼし、ストレスおよび熱ショック応答遺伝子77,1212の発現を誘発する可能性がある。さらに、解離中の洗剤の使用は、核膜を破裂させ、凝集23、25,25を導くことができる。したがって、最高品質の単一の細胞または核懸濁液を得るために解離を最適化することが、ハイスループットプロファイリング実験の成功にとって最も重要である。
ここでは、ゼブラフィッシュの脳から20分以内に無傷の核を抽出できる洗剤と酵素を含まない核分離法を実証する。プロトコルは、典型的な形態と堅牢な完全性を有する核を生成する(図2)。6mgの重さの単一のゼブラフィッシュ脳から、プロトコルは、ヘモサイトメーター数によって決定される合計60,000核を生成します。単離された核は、snRNA-seq、ATAC-seqおよび免疫染色を含む複数の下流の適用のために利用することができる。単離された核には、細胞質画分からの交差汚染、特に小胞体およびミトコンドリアの成分からの交差汚染が含まれ得る。ハイスループットプロファイリング実験では、細胞デブリ、特にミトコンドリアのクリアランスが強く推奨されます。フローサイトメトリー(図3)は、核の精製のための実行可能な選択肢を提供する。あるいは、スクロース勾配は、破片の除去のために利用することもできる。
このプロトコルは、マウス甲状腺(データは示されていない)でテストされており、ゼブラフィッシュの脳組織に似た結果を提供します。全体的に見て、このプロトコルは、単一核懸濁液の調製のための堅牢で再現性のある普遍的な方法を提供し、ハイスループットプロファイリング実験のための物流を簡素化するのに役立ちます。
The authors have nothing to disclose.
サビーン・コスタグリオラ博士とシン研究所のメンバーに、原稿に関するコメントに感謝します。この作品は、グラント番号34772792 -MISUからS.P.S.に、フォン・デ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィック-FNRSによって支えられた。
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |