单核分离依赖于细胞膜的分离和基于洗涤剂的渗透,这些步骤需要优化,并且容易引入技术伪影。我们演示了一种洗涤剂和无酶协议,用于直接从整个组织中快速分离完整的核,产生适合单核RNA-seq(snRNA-Seq)或 ATAC-seq 的核。
高通量转录组和表观基因组分析需要准备单个细胞或单核悬浮液。使用完整的细胞或核准备悬浮液涉及分离和渗透,这些步骤可能会引入不必要的噪音和不良损伤。特别是,某些细胞类型,如神经元是具有挑战性的分离成单个细胞。此外,细胞膜的渗透释放核需要通过试验和错误进行优化,这既耗时、劳动密集型且经济上不可行。为了提高高通量测序样品制备的鲁棒性和可重复性,我们描述了一种快速酶和无洗涤剂柱基分离方法。该协议可在20分钟内有效分离出整个斑马鱼大脑的核。分离的核显示完整的核形态和低聚集倾向。此外,流式细胞学允许细胞碎片的核富集和清除,用于下游应用。该协议应作用于软组织和培养细胞,为样品制备提供了一种简单易用的方法,可用于高通量分析,简化了成功单核RNA-seq和 ATAC-seq 实验所需的步骤。
单细胞RNA-seq(scRNA-seq)和AC-seq是研究单细胞分辨率的复杂生物系统的多功能工具。它们被广泛用于定义细胞亚型和状态、基因网络以及评估细胞异质性。执行 scRNA-seq 的先决条件是通过组织分离制备单个细胞悬浮液。由于细胞外基质组成和机械性能的变化,单个组织需要优化分离协议,以制备单细胞悬浮液。
将组织分离成单细胞通常涉及在37°C1、2、3、4,2,3的消化酶(包括胶原酶、解胃或三辛)的治疗4。由于转录机械在37°C时保持活跃,酶分离可以引入mRNA表达伪影和噪声,5,6。值得注意的是,长时间的孵育可以以不均匀的方式诱导应激反应基因和热休克反应,导致实验7的技术变异性。
生成单个细胞悬浮的另一个缺点是难以获得具有复杂形态的可行和完整的细胞类型。特别是,神经元、脂肪细胞和豆瓣细胞在分离,,8、9、10、11方面具有挑战性。8,910例如,吴和他的同事证明,在成年小鼠肾脏12的scRNA配置文件中,没有球状豆瓣细胞。对于从脑组织8、13、14中恢复相互关联的神经元,也进行了类似的不理想观察。总之,分离协议可以引入检测偏差,倾向于更容易分离细胞类型,从而导致对器官细胞结构的歪曲。
为了克服在scRNA-Seq.样品制备过程中引入的技术噪声和偏差,分离和分析核提供了一个有吸引力的替代方案。由于核形态在不同细胞类型之间相似,核的分离绕过了用复杂形态分离完整和可行的细胞的问题。例如,吴和他的同事用成年小鼠肾脏的单核RNA-Seq.(snRNA-Seq.)成功地分析球状豆瓣细胞,从scRNA-Seq12中缺失。有趣的是,单细胞和单核RNA-seq之间的比较研究表明,使用snRNA-Seq12的应激和热休克反应基因的诱导率减少。研究进一步表明,这两种方法检测的基因之间高度相关。然而,最近一项有关人类微胶质的研究未能发现阿尔茨海默氏症的基因活化。因此,在某些情况下,snRNA-Seq是scRNA-Seq16,17,的合适替代品。此外,核隔离可用于单细胞 ATAC-Seq.,提供有关单个细胞内开放染色质区域的信息。
核分离协议涉及三个主要步骤:(一) 基于洗涤剂的细胞膜解解释放细胞核;ii) 使用 Dounce 均质器组织均质化;和,iii) 利用梯度离心或流式细胞学18、19、20、21、22,,19,20富集核和清除细胞碎片。其中,前两个步骤取决于组织类型,需要经验优化。轻度洗涤剂导致细胞膜部分破裂,从组织23中提取核效率低下。另一方面,高水平的洗涤剂和苛刻的同质化导致核膜破裂,其损失24,25。24,断裂的核进一步倾向于聚集在一起并形成聚合,如果不删除,可能导致下游分析实验中的伪影。
为了规避与核分离的洗涤剂优化相关的问题,我们引入了一种协议,使用无洗涤剂和自旋柱方法将完整的核从新鲜样品中分离。该协议在20分钟内从整个器官产生核,限制了神器转录的诱导。分离的核可与单核RNA-Seq.和 ATAC-seq 的 FACS 丰富,提供一种简单且通用的方法,可实现可靠且可重复的高通量分析。
以单细胞分辨率分析转录组和表观基因组,彻底改变了生物系统的研究。固体组织单个细胞的分辨率研究取决于器官分离成单个细胞或核。分离是一个破坏性的过程,可以引入技术工件,它可以阻止系统5,6的准确表示。例如,酶分离可以伤害具有复杂形态的细胞,如神经元或豆瓣细胞,并可诱导压力和热休克反应基因7,12,的表达。此外,在分离过程中使用洗涤剂可能会破裂核膜,并导致聚集23,25。23,因此,优化分离以获得最高质量的单细胞或核悬浮液对于高通量分析实验的成功至关重要。
在这里,我们演示一种洗涤剂和无酶核分离方法,允许在20分钟内从斑马鱼大脑中提取完整的核。该协议产生具有典型形态和强健完整性的核(图2)。从一只重达6毫克的斑马鱼大脑中,该协议总共产生60,000个核,由血细胞计计数确定。分离的核可用于多种下游应用,包括snRNA-seq、ATAC-seq和免疫污染。分离的核可能包括来自细胞质部分的交叉污染,特别是来自内质性细胞和线粒体的成分。对于高通量分析实验,强烈建议清除细胞碎片,特别是线粒体。流细胞学 (图3) 为核的纯化提供了可行的选择.或者,蔗糖梯度也可用于清除碎屑。
该协议已经测试在小鼠甲状腺(数据未显示),并提供的结果类似于斑马鱼脑组织。总体而言,该协议为制备单核悬浮提供了一种稳健、可重复和通用的方法,有助于简化高通量分析实验的物流。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢萨宾·科斯塔利奥拉博士和辛格实验室的成员对手稿的评论。这项工作得到了编号34772792-MISU至S.P.S.的”科学基金会”的支持。
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |