Enkele kernisolatie is afhankelijk van dissociatie en detergent-gebaseerde permeabilisatie van het celmembraan, stappen die optimalisatie nodig hebben en gevoelig zijn voor de invoering van technische artefacten. We demonstreren een wasmiddel- en enzymvrij protocol voor snelle isolatie van intacte kernen rechtstreeks uit hele weefsel, wat kernen oplevert die geschikt zijn voor single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) of ATAC-seq.
High-throughput transcriptome en epigenome profilering vereist voorbereiding van een enkele cel of enkele kernen schorsing. Voorbereiding van de suspensie met intacte cel of kernen omvat dissociatie en permeabilisatie, stappen die ongewenste ruis en ongewenste schade kunnen veroorzaken. In het bijzonder, bepaalde cel-types zoals neuronen zijn een uitdaging om te scheiden in individuele cellen. Bovendien, permeabilisatie van het cellulaire membraan om kernen vrij te geven vereist optimalisatie door trial-and-error, die tijdrovend, arbeidsintensief en financieel niet levensvatbaar kan zijn. Om de robuustheid en reproduceerbaarheid van monsterpreparaat voor hoge doorvoersequenties te verbeteren, beschrijven we een snelle enzym- en detergent-vrije kolomgebaseerde isolatiemethode op basis van kernen. Het protocol maakt een efficiënte isolatie van kernen van de hele zebravis hersenen binnen 20 minuten. De geïsoleerde kernen tonen intacte nucleaire morfologie en lage neiging tot aggregaat. Verder, flow cytometrie maakt kernen verrijking en klaring van cellulair puin voor downstream toepassing. Het protocol, dat moet werken op zachte weefsels en gekweekte cellen, biedt een eenvoudige en toegankelijke methode voor monstervoorbereiding die kan worden gebruikt voor high-throughput profiling, waardoor de stappen die nodig zijn voor succesvolle single-nuclei RNA-seq en ATAC-seq experimenten worden vereenvoudigd.
Single-cell RNA-seq (scRNA-Seq) en ATAC-seq zijn veelzijdige instrumenten om complexe biologische systemen te bestuderen op eencellige resolutie. Ze worden op grote schaal gebruikt om celsubtypes en toestanden, gennetwerken te definiëren en cellulaire heterogeniteit te beoordelen. Een voorwaarde voor het uitvoeren van scRNA-seq is de voorbereiding van een enkele cel suspensie door weefseldissociatie. Vanwege de variatie in de extracellulaire matrixsamenstelling en mechanische eigenschappen vereisen individuele weefsels optimalisatie van het dissociatieprotocol voor de voorbereiding van eencellige suspensie.
Dissociatie van weefsels in enkele cellen omvat meestal behandeling met spijsverteringsenzymen, waaronder collagenase, dispase of trypsine, bij 37 °C1,2,3,4. Aangezien transcriptiemachines actief blijven bij 37 °C, kan enzymatische dissociatie mRNA-expressieartefacten en ruis5,6introduceren . Met name langdurige incubatie kan stressresponsieve genen en warmteschokrespons op een niet-uniforme manier veroorzaken , wat leidt tot technische variabiliteit in het experiment7.
Een ander nadeel van het genereren van een eencellige suspensie is de moeilijkheid bij het verkrijgen van levensvatbare en intacte celtypes met complexe morfologieën. Met name neuronen, adipocyten en podocyten zijn een uitdaging om8,9,10,,11te isoleren . Wu en collega’s toonden bijvoorbeeld de afwezigheid van glomerulaire podocyten in scRNA-profielen van een volwassen muizennier12. Soortgelijke niet-optimale waarnemingen zijn gedaan met betrekking tot het herstel van onderling verbonden neuronen uit hersenweefsel8,13,14. Kortom, dissociatieprotocollen kunnen detectiebias introduceren in de richting van gemakkelijker te scheiden van celtypen, wat leidt tot een verkeerde voorstelling van de cellulaire architectuur van het orgaan.
Om de technische ruis en vooringenomenheid te overwinnen die tijdens de monstervoorbereiding in scRNA-Seq zijn geïntroduceerd, biedt isolatie en profilering de kern een aantrekkelijk alternatief. Aangezien nucleaire morfologie vergelijkbaar is tussen verschillende celtypen, omzeilt isolatie van de kernen de kwestie van het isoleren van intacte en levensvatbare cellen met complexe morfologieën. Wu en collega’s demonstreerden bijvoorbeeld succesvolle profilering van glomerulaire podocyten met de single-nucleus RNA-Seq. (snRNA-Seq.) van een volwassen muizennier, die ontbrak in scRNA-Seq12. Intrigerend, vergelijkende studies tussen eencellige en single-nucleus RNA-seq hebben gesuggereerd een afname van de inductie van stress en warmte-shock response genen met snRNA-Seq12. De studies suggereren verder een hoge correlatie tussen de genen gedetecteerd door de twee methoden. Echter, een recente studie over menselijke microglia niet op te sporen genetische activering bij de ziekte van Alzheimer15. In bepaalde contexten is snRNA-Seq dus een geschikt alternatief voor scRNA-Seq16,17. Bovendien kan de nucleaire isolatie worden gebruikt voor eencellige ATAC-Seq., het verstrekken van informatie over de regio’s van open chromatine binnen individuele cellen.
Het protocol voor kernisolatie omvat drie belangrijke stappen: i) wasmiddelgebaseerde lyse van celmembraan om de kern vrij te geven; ii) weefselhomogenisatie met behulp van een Dounce homogenisator; en iii) verrijking van kernen en verwijdering van celpuin met behulp van gradiëntcentrifugatie of stroomcytometrie18,19,20,21,22. Onder deze, de eerste twee stappen zijn afhankelijk van het weefsel type en moeten empirisch worden geoptimaliseerd. Mild wasmiddel leidt tot gedeeltelijke breuk van het celmembraan en het inefficiënt ophalen van kernen uit het weefsel23. Aan de andere kant leidt een hoog niveau van wasmiddel en harde homogenisatie tot breuk van het kernmembraan en hun verlies24,25. Gescheurde kernen hebben verder de neiging om samenklonteren en vormen aggregaten, die zo niet verwijderd kan leiden tot artefacten in de downstream profilering experiment.
Om de problemen met betrekking tot wasmiddeloptimalisatie voor kernisolatie te omzeilen, introduceren we een protocol om intacte kernen te isoleren van verse monsters met behulp van een op wasmiddel- en spinkolom gebaseerde methode. Het protocol levert kernen van het hele orgaan binnen 20 minuten, het beperken van de inductie van artefactuele transcriptie. De geïsoleerde kernen kunnen worden verrijkt met FACS voor single-nuclei RNA-Seq. en ATAC-seq, waardoor een eenvoudige en universele methode is die robuuste en reproduceerbare high-throughput profiling mogelijk maakt.
Profilering van de transcriptoom en epigenoom op een eencellige resolutie heeft een revolutie teweeggebracht in de studie van biologische systemen. Studies bij de resolutie van een enkele cel voor een vast weefsel zijn afhankelijk van de dissociatie van het orgaan in individuele cellen of kernen. Dissociatie is een destructieve procedure die technische artefacten kan introduceren, die de ontwikkeling van een nauwkeurige weergave van het systeem5,6kunnen voorkomen . Enzymatische dissociatie kan bijvoorbeeld cellen met complexe morfologieën schaden, zoals neuronen of podocyten, en kan expressie van stress en warmteschokreactiegenenveroorzaken 7,12. Bovendien kan het gebruik van wasmiddel tijdens dissociatie het nucleaire membraan scheuren en leiden tot aggregatie23,25. Het optimaliseren van de dissociatie voor het verkrijgen van een enkele cel of kernensuspensie van de hoogste kwaliteit is dus van het grootste belang voor het succes van high-throughput profiling experimenten.
Hier demonstreren we een wasmiddel- en enzymvrije nuclei-isolatiemethode die extractie van intacte kernen uit zebravissen hersenen in minder dan 20 minuten mogelijk maakt. Het protocol levert kernen op met typische morfologie en robuuste integriteit(figuur 2). Van een enkele zebravis hersenen met een gewicht van 6 mg, het protocol levert een totaal van 60.000 kernen bepaald door een hemocytometer tellen. De geïsoleerde kernen kunnen worden gebruikt voor meerdere downstream toepassingen, waaronder snRNA-seq, ATAC-seq en immunostaining. De geïsoleerde kernen kunnen kruisbesmetting van cytoplasmische breuken omvatten, met name van componenten van endoplasmisch reticulum en mitochondriën. Voor high-throughput profilering experimenten, speling van cellulair puin, met name mitochondriën, wordt sterk aanbevolen. Flow cytometrie(figuur 3) biedt een haalbare optie voor de zuivering van kernen. Als alternatief kan de sacharosegradiënt ook worden gebruikt voor het verwijderen van puin.
Het protocol is getest op de schildklier van de muis (gegevens niet getoond) en biedt resultaten vergelijkbaar met zebravis hersenweefsel. Over het geheel genomen biedt het protocol een robuuste, reproduceerbare en universele methode voor de voorbereiding van enkele nucleus-ophanging, waardoor de logistiek voor high-throughput profiling-experimenten wordt vereenvoudigd.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken leden van het Dr. Sabine Costagliola en Singh lab voor commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS onder Grant nummer 34772792 – MISU aan S.P.S.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |