Este estudio detalla el proceso de cantidades precisas de gavaging de probióticos a los ratones neonatales. El montaje experimental se optimizó para incluir pero no se limita a probiótico, la dosis, métodos de administración y cuantificación de bacterias en los intestinos.
Modelos de ratón adulto se han utilizado ampliamente para entender el mecanismo detrás de progresión de la enfermedad en los seres humanos. La aplicabilidad de los estudios realizados en modelos de ratón adulto a enfermedades neonatales es limitada. Para entender mejor la progresión de la enfermedad, las respuestas de los host y repercusiones a largo plazo de las intervenciones en recién nacidos, un modelo de ratón neonatal probable es un ajuste mejor. El escaso uso de modelos de ratón neonatal puede atribuirse en parte a las dificultades técnicas de trabajar con estos pequeños animales. Se desarrolló un modelo de ratón neonatal para determinar los efectos de la administración de probiótico en los primeros años de vida y evaluar específicamente la capacidad de establecer la colonización en el tracto intestinal del ratón recién nacido. En concreto, para evaluar la colonización del probiótico en el ratón neonatal, Lactobacillus plantarum (LP) fue entregado directamente en el aparato gastrointestinal del ratón neonatal. Con este fin, LP fue administrado a ratones por alimentación por gavage (IE) intra-del esófago. Se desarrolló un método altamente reproducible para estandarizar el proceso de alimentación forzada de IE que permite una administración exacta de dosis del probiótico minimizando el trauma, un aspecto particularmente importante dado la fragilidad de ratones recién nacidos. Limitaciones de este proceso incluyen posibilidades de daño o irritación del esófago y la aspiración si gavaged incorrectamente. Este enfoque representa una mejora en las prácticas actuales ya por sonda nasogástrica en la IE en el esófago distal reduce las posibilidades de aspiración. Siguiendo por sonda nasogástrica, se trazó el perfil de colonización de los probióticos usando la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) del ADN extraído intestinal con iniciadores específicos de LP. Configuración de diferente camada y técnicas de gestión de la jaula fueron utilizadas para evaluar el potencial para la extensión de la colonización. El protocolo detalla los entresijos de la sonda nasogástrica de ratón neonatal de IE y cuantificación posterior colonización con LP.
En niños, la exposición temprana de probióticos ha sido asociada con efectos inmunomoduladores a reducción en la incidencia de enfermedades como la enterocolitis necrotizante, dermatitis atópica y sepsis1,2,3, 4 , 5. sin embargo, el mecanismo detrás de esta respuesta inmunomoduladora es un reto explorar dada la limitación para la toma de muestras en recién nacidos humanos (es decir, sangre alternativamente atrae y biopsias). Modelos de ratón neonatal pueden ayudar a estudiar el mecanismo de acción involucrado en la regulación inmune neonatal asociada con el uso de probióticos y cambios en la microbiota intestinal. Desafortunadamente, la mayoría modelos de ratón para probióticos en gran parte se han centrado en ratones adultos; sin embargo, el impacto de los probióticos es probable ser más alto temprano en la vida, sugiriendo modelos específicos para este grupo de edad será útil3,6. Además, modelos de ratón neonatal son más apropiados para el estudio de las enfermedades y las intervenciones destinadas a aplicación en la vida temprana de los infantes como se espera que más de cerca imitar un desarrollo sistema inmunitario y microbiano7,8 ,9,10. El objetivo fue estudiar la magnitud y los patrones de colonización de probiótico de ratones neonatales con énfasis en la interacción mecanicista entre el host y su microbioma. Adecuadas descripciones de modelos recién nacidos no fueron encontradas en la literatura, y así se abordó la necesidad para el desarrollo del método robusto y estándar.
Métodos establecidos de la administración oral de diferentes compuestos a ratones recién nacidos incluyen a la transferencia de compuestos deseados a través de la leche por tratar la fuente de agua para presas embarazadas11 o utilizando una aguja de alimentación para facilitar la administración de compuestos deseados en la orofaringe12. Estos métodos son útiles para los experimentos que no tienen requisitos de dosificación exacta y donde el tratamiento es fácilmente ingerido por el ratón receptor. Los probióticos se administran a menudo en conjunción con un prebiótico como galactooligosaccharide y fructooligosaccharide (FOS) que sirven como fuente de nutrición para las bacterias probióticas; Estos compuestos aditivos hacen de la solución viscosa y difícil de administrar a través de las metodologías mencionadas. Idear un método para administrar cantidades precisas de los probióticos y prebióticos a ratones recién nacidos a partir tan pronto como el primer día de vida (DOL) era necesario. En el desarrollo de la técnica de sonda nasogástrica, la posibilidad de la extensión de la colonización (como se observa en otros estudios de probióticos entre el tratamiento y el control armas13,14,15,16) fue probado y se evaluó la abundancia relativa de colonizado Lactobacillus plantarum (LP) en los intestinos de los cachorros con horarios diferentes por sonda nasogástrica. La preparación de probióticos utilizada en los experimentos consistió en 109 unidades formadoras de colonias (UFC) por sonda nasogástrica de LP (cepa ATCC-202195), mezclado con FOS (prebiótico) y maltodextrina (excipiente) como se describe en el reciente ensayo humano3. El suministro de probióticos se realizó mediante sonda nasogástrica de la IE y el proceso se detalla en el protocolo a continuación. El perfil de colonización de los probióticos se evaluó utilizando en tiempo real la amplificación de ADN extraído de los intestinos todo usando las cartillas específicas LP.
El procedimiento de la sonda nasogástrica de IE fue desarrollado para administrar con seguridad una dosis específica de un probiótico a ratones neonatales. Pequeñas cantidades de líquido se entregan en el tracto gastrointestinal superior usando una aguja de alimentación para prevenir la aspiración mientras se asegura la entrega de la dosis de confianza. Los intestinos de los ratones fueron recogidos para el análisis de la colonización dos y seis días después por sonda nasogástrica. El procedimiento para la extracción de ADN fue modificado para asegurar alto rendimiento del organismo probiótico Gram-positivas. El análisis de qPCR de la DNA extraen dos días post última sonda mostraron relativamente mayor colonización de LP en ratones gavaged cada dos días en comparación con ratones gavaged cada día entre DOL 2-8. También hubo una disminución en la cantidad de LP durante seis días, mostrando este probiótico que un organismo transitorio en el intestino del ratón. Los resultados de estos experimentos establecen las condiciones para llevar a cabo investigación con alto rigor en este grupo de edad.
Para observar los efectos a largo plazo de los probióticos en ratones neonatales, se administró a ratones neonatales en DOL 2; un tiempo partido similar señalan el juicio humano. Orofaríngeo de alimentación de ratones neonatales es descrita en la literatura y se ha realizado sólo después de12,DOL 5 817 cuando el riesgo de aspiración es bajo debido a una mecánica de deglución bien desarrollada. Sin embargo, alimentación orofaríngea no es idóneo para ratones 2 DOL como tasas más altas de aspiración se observaron en el estudio piloto (datos no mostrados). La naturaleza viscosa del probiótico y prebiótico solución agregado al riesgo de aspiración. Siguiendo el procedimiento de gavaging de IE reducen al mínimo el riesgo de aspiración en DOL 2 ratones mientras que entrega el volumen deseado directamente en el tracto gastrointestinal superior. El éxito del procedimiento primero se validó utilizando colorante infundido probiótico por sonda nasogástrica. El colorante de alimento actúa como un marcador que es visible a través de la piel del cachorro. No hay efectos negativos fueron observados en ratones gavaged con colorante, y se recomienda validar el procedimiento de gavaging de esta manera antes de comenzar los experimentos a gran escala. La rápida resolución de la sonda refleja post visto jadeando también puede utilizarse como un indicador adicional para una exitosa por sonda nasogástrica. Una vez que el ratón se coloca sobre la manta la sonda nasogástrica, reflejo del jadeo se desplomará y se observará un aumento en la frecuencia de la respiración dentro de 20 segundos. La continuación del reflejo del jadeo durante más de 30 segundos indica un fallido por sonda nasogástrica. Sonda nasogástrica éxito también depende de adecuada inserción de la aguja de alimentación con el bulbo sentado justo encima de la abertura del esfínter cardiaco del estómago. Esto puede facilitarse al asegurar que la marca de la aguja de medición de la longitud entre el proceso xiphoid y la punta del hocico, no pasar el hocico del ratón durante la alimentación forzada. Esto minimiza la posibilidad de lesiones al ratón. La frecuencia de la sonda nasogástrica puede tener un impacto significativo en los resultados experimentales. Gavaging frecuente también puede crear más estrés para los cachorros y la madre debido a la constante perturbación de la jaula y el nido. El horario más óptimo de sonda es cuando el gavages son las menos frecuentes y durante un tiempo más corto de tiempo sin perder el efecto esperado en el sistema. Para garantizar la seguridad y esterilidad del procedimiento de la sonda aguja debe ser esterilizada por autoclave entre uso y lavado. Lavar rigurosamente en el exterior utilizando un exfoliante el interior forzando el agua a través de la aguja con una jeringa antes de autoclave es necesario como las partículas de restos puede incrustar en la aguja durante la esterilización en autoclave y puede interferir con el procedimiento de gavaging.
Mayor colonización del LP fue observada en crías que fueron gavaged cada otro día en comparación con gavaged los cachorros todos los días. Esto puede ser debido a la tensión reducida en cachorros gavaged día y potencialmente probióticas obteniendo más nutrientes a través de la relativamente más leche ingerida por estos cachorros. La dependencia de la dosis del tratamiento con probióticos ha sido estudiada previamente en modelos de ratón18,19 y por lo tanto es importante la administración de la dosis correcta. La solución de probiótico elaborada es plateada antes de cada sonda nasogástrica para obtener un conteo preciso de UFC administrado. Si el organismo probiótico es anaeróbico, es importante ver si hay diferencia en la UFC cuando cultivan aeróbicamente o anaeróbicamente. LP es un anaerobio facultativo, fue cultivado usando ambos métodos y no se observó ninguna diferencia en la UFC.
Post por sonda nasogástrica intestinal LP carga análisis se realizó utilizando muestras de ADN de qPCR y de alta calidad. Para minimizar la contaminación del ADN de LP entre el tratamiento y los grupos de control, diferentes alimentación agujas, gabinetes de bioseguridad y equipos quirúrgicos fueron utilizados para muestras de calidad más altas. La medida exacta de los probióticos en el intestino requiere de un método optimizado de extracción de ADN. Métodos más eficientes para la extracción de ADN de heces implica múltiples grano superando pasos20,21,22. Este método fue adoptado para la extracción de bacterias intestinales con paliza de grano y observa representación disminuida (< 10 copias2 recuperados) de LP en la extracción de ADN completamente del intestino. LP es un Gram positivo organismo con una substancial cantidad de peptidoglicano en la pared celular, se optimizó el protocolo con un paso de la disolución de peptidoglicano usando lisozima23,24 añadido al buffer de lisis enzimática. Esto aumentó la representación de LP en la misma muestra intestinal por más de dos veces. El tratamiento de lisozima asegura la disolución de la capa externa, mientras que el grano a paso facilita la lisis del organismo. Optimización de la cantidad de tejido, el tipo de grano de granate y la duración de la interrupción con los granos es necesarios para la obtención de productos de DNA óptimo para llevar a cabo el análisis PCR.
Los efectos positivos de los probióticos administrados como profilaxis o tratamiento en los recién nacidos pre término y término se evidencia en recientes estudios25,26,27,28. El establecimiento de un modelo de ratón neonatal adecuada de probióticos está garantizado para desempaquetar el efecto protector de los probióticos. Este protocolo descrito aquí representa a una guía para los investigadores que no estén familiarizados con el trabajo de ratón neonatal con probióticos. No obstante lo dispuesto en el problemas con roedor microbiota mientras estudiaba la enfermedad y la salud humana, este método puede ampliarse a la investigación se centró en la comprensión de los cambios de la microbioma por probióticos. Este modelo también proporciona una plataforma para estudiar la interacción huésped-microbio y respuestas inmunes a lo largo de diferentes etapas de desarrollo.
The authors have nothing to disclose.
Gracias al personal del centro de cuidados de animales y los veterinarios UBC para entrenamiento y asistencia en el ratón funcionan en el Instituto de investigación del Hospital de niños BC. Gracias a la Universidad de British Columbia y el Departamento de Medicina Experimental para el estudio de la financiación.
1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |