Este estudo detalha o processo de quantidades precisas de gavaging de probióticos para camundongos neonatais. A montagem experimental foi otimizada para incluir, mas não está limitada ao probiótico dosagem, métodos de administração e quantificação de bactérias no intestino.
Modelos do rato adulto foram amplamente utilizados para entender o mecanismo por trás da progressão da doença em seres humanos. A aplicabilidade de estudos realizados em modelos do rato adulto para neonatais é limitada. Para entender melhor a progressão da doença, acolhimento respostas e impacto a longo prazo das intervenções em neonatos, um modelo do rato neonatal provável é um melhor ajuste. O uso esparso de modelos do rato neonatal em parte pode ser atribuído às dificuldades técnicas de trabalhar com esses pequenos animais. Foi desenvolvido um modelo de rato neonatal para determinar os efeitos da administração de probióticos no início da vida e para avaliar especificamente a capacidade de estabelecer a colonização no tracto intestinal de rato recém-nascido. Especificamente, para avaliar a colonização de probiótico no mouse neonatal, Lactobacillus plantarum (LP) foi entregue diretamente no trato gastrointestinal neonatal do mouse. Para este fim, LP foi administrado a ratos alimentando através de intraesofágico gavagem (IE). Foi desenvolvido um método altamente reprodutível para padronizar o processo de gavage IE que permite uma administração precisa de probiótico dosagens, minimizando o trauma, um aspecto particularmente importante dado a fragilidade dos ratos recém-nascidos. As limitações deste processo incluem possibilidades de irritação esofágica ou danos e aspiração se gavaged incorretamente. Esta abordagem representa uma melhoria nas práticas actuais porque gavage de IE para o esôfago distal reduz as chances de aspiração. Após a intubação, o perfil de colonização do probiótico foi rastreado usando a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) do DNA extraído intestinal com primers específicos de LP. Ninhada de diferentes configurações e técnicas de gestão de gaiola foram utilizadas para avaliar o potencial de propagação da colonização. O protocolo detalha os meandros da gavagem de rato neonatal do IE e quantificação de colonização subsequente com LP.
Em crianças, a exposição precoce de probiótico tem sido associada com efeitos imunomoduladores, levando à redução da incidência de doenças como necrosante enterocolite, dermatite atópica e sepse1,2,3, 4 , 5. no entanto, o mecanismo por trás desta resposta imuno é um desafio para explorar dada a limitação de amostragem recém-nascido em ensaios em humanos (ou seja, sangue sequencial e biópsias). Modelos de rato neonatal podem ajudar a estudar o mecanismo de ação envolvido no Regulamento imune neonatal, associado com uso de probiótico e alterações da microbiota intestinal. Infelizmente, a maioria dos modelos de rato para probióticos têm focados em ratos adultos; no entanto, o impacto dos probióticos é susceptível de ser mais alto no início da vida, sugerindo modelos específicos para este grupo etário será útil3,6. Além disso, modelos de rato neonatal são mais adequados para estudar doenças e intervenções destinadas a aplicação no início da vida dos bebês humanos como eles são esperados para imitar mais de perto um desenvolvimento sistema imune e microbiana7,8 ,9,10. O objetivo foi estudar a extensão e os padrões de colonização de probiótico de ratos neonatais com foco na interação entre o host e seu microbiome mecanicista. Apropriado descrições dos modelos de recém-nascido não foram encontradas na literatura, e, portanto, uma necessidade para o desenvolvimento de um método robusto e padronizado foi abordada.
Estabelecidos métodos de administração oral de vários compostos de ratos recém-nascidos incluem transferência materna de compostos desejadas através do leite, tratando a fonte de água para barragens grávida11 ou usando agulhas alimentação para facilitar a administração de compostos desejados para a orofaringe12. Esses métodos são úteis para experiências que não têm requisitos de dosagem precisa e onde o tratamento é facilmente ingerido pelo destinatário mouse. Probióticos são frequentemente administrados em conjunto com um prebiótico como galactooligosaccharide e fructooligosaccharide (FOS) que servem como fonte de nutrição para as bactérias probióticas; Estes aditivos compostos tornam a solução viscosa e desafiador para administrar através das metodologias acima mencionadas. Conceber um método para administrar quantidades precisas de probióticos e prebióticos para ratos recém-nascidos começando tão cedo quanto o primeiro dia de vida (DOL) era necessário. No processo de desenvolvimento da técnica de gavagem, a possibilidade de propagação da colonização (como observado em outros estudos de probiótico entre o tratamento e o controle braços13,14,15,16) foi testado e a abundância relativa de colonizado Lactobacillus plantarum (LP) no intestino dos filhotes com horários diferentes gavagem foi avaliada. A preparação de probiótico utilizada nos experimentos consistiu de 10 unidades de formadoras9 (CFU) por gavagem de LP (cepa ATCC-202195), misturado com FOS (prebiótico) e maltodextrina (excipiente), conforme descrito no recente julgamento humano3. A entrega de probiótico foi realizada utilizando gavage IE e o processo é detalhado no protocolo abaixo. O perfil de colonização do probiótico foi avaliado usando o tempo real de amplificação do DNA extraído todo intestinos utilizando primers específicos de LP.
O procedimento de gavage IE foi desenvolvido para administrar com segurança uma dose específica de um probiótico para camundongos neonatais. Pequenas quantidades de líquido são entregues ao tracto gastrointestinal superior usando uma agulha de alimentação para evitar a aspiração, garantindo a entrega da dose de confiança. Os intestinos dos ratos foram coletados para análise de colonização dois e seis dias post gavage. O procedimento para extração de DNA foi modificado para garantir alto rendimento do organismo Gram-positivas de probiótico. A qPCR análise do DNA extraído dois dias post último gavagem mostrou relativamente maior colonização de LP em camundongos gavaged em dois dias, em comparação com os ratos gavaged todos os dias entre DOL 2-8. Houve também uma diminuição na quantidade de LP durante seis dias, mostrando este probiótico para ser um organismo transiente no intestino do rato. Os resultados destes experimentos estabelecem as condições para realizar pesquisas com elevado rigor neste grupo etário.
Para observar os efeitos a longo prazo dos probióticos em camundongos neonatais, foi administrado a ratos neonatais em DOL 2; um tempo de partida semelhante, aponte para o julgamento humano. Alimentação da orofaringe dos ratos neonatais é descrito anteriormente na literatura e foi realizada somente após DOL 5-812,17 quando o risco de aspiração é menor devido a uma mecânica de deglutição bem desenvolvida. No entanto, alimentação da orofaringe não é adequado para DOL 2 ratos como taxas mais elevadas de aspiração foram observadas no estudo piloto (dados não mostrados). A natureza viscosa do probiótico e prebiótica solução adicionado ao risco de aspiração. Seguir o procedimento de gavaging IE minimizado o risco de aspiração em DOL 2 ratos ao entregar o volume desejado diretamente para o trato gastrointestinal superior. O sucesso do procedimento foi primeiro validado usando corante alimentício infundido gavage probiótico. A coloração de alimento atua como um marcador que é visível através da pele do filhote. Sem efeitos negativos foram observados em ratos gavaged com corante alimentar, e é recomendável para validar o procedimento de gavaging desta forma antes de iniciar as experiências em larga escala. A resolução rápida do ofegante gavage reflexo visto post também pode ser usada como um indicador adicional para uma bem sucedida gavage. Uma vez que o mouse é colocado sobre o cobertor térmico pós-gavage, o reflexo ofegante vai diminuir e um aumento da frequência de respiração será observado dentro de 20 segundos. A continuação do reflexo ofegante durante mais de 30 segundos indica uma falha gavage. Gavage sucesso também depende de adequada inserção da agulha alimentação com o bulbo sentado bem em cima da abertura do esfíncter cardíaco do estômago. Isto pode ser facilitado, garantindo que a marcação na agulha medindo o comprimento entre o processo xifoide e a ponta do focinho, não passar o focinho do rato durante a intubação. Isso minimiza a chance de lesão para o mouse. A frequência de gavage pode ter um impacto significativo sobre os resultados experimentais. Gavaging frequente também pode criar mais stress para os filhotes e a mãe devido a constante perturbação da gaiola e do ninho. O cronograma de gavage mais ideal é quando os gavages são as menos frequentes e em uma duração mais curta de tempo sem perder o efeito esperado no sistema. Para garantir a segurança e a esterilidade do procedimento o gavage agulha deve ser esterilizada por lavagem e uso nas entrelinhas de autoclavagem. Lavagem com rigor sobre o exterior usando um esfoliante e dentro, forçando a água através da agulha, utilizando uma seringa antes da autoclavagem é necessária como qualquer sobras partículas podem encrust na agulha durante a autoclavagem e podem interferir com o processo de gavaging.
Maior colonização LP foi observada em filhotes que estavam gavaged cada outro dia, quando comparado aos filhotes gavaged todos os dias. Isto pode ser devido o esforço reduzidos em filhotes gavaged todos os dias e, potencialmente, o probiótico ficando mais nutrientes através do leite relativamente mais ingerido por esses filhotes. A dependência da dose de tratamento probiótico foi estudada anteriormente no rato modelos18,19 , e, portanto, a administração da dose correta é importante. Probiótico solução preparada é chapeada antes cada gavagem para obter uma contagem exata de UFC administrado. Se o organismo probiótico é anaeróbico, é importante ver se há diferença na UFC quando cultivadas por via aeróbia ou anaeróbia. Desde que o LP é um anaerobe facultative, ele foi cultivado usando ambos os métodos e não no UFC foi observada diferença.
A análise de carga do post gavage intestinal LP foi feita usando amostras de DNA de qPCR e alta qualidade. Para minimizar a contaminação de DNA LP entre o tratamento e os grupos de controle, diferente de alimentação agulhas, armários de segurança biológica e equipamentos cirúrgicos foram usados para assegurar amostras de qualidade mais alta. A medida exata do probiótico no intestino necessário um método de extração de DNA otimizado. Métodos mais eficientes para a extração de DNA de fezes envolve múltiplos do grânulo batendo passos20,21,22. Esse método foi adotado para a extração de bactérias intestinais usando o espancamento do grânulo e observado a representação diminuída (< 10 cópias de2 recuperadas) de LP na extração de DNA a todo o intestino. Como LP é um organismo de Gram positivo com uma quantidade substancial de peptidoglicano na parede celular, o protocolo foi otimizado com uma etapa de dissolução de peptidoglicano usando lisozima23,24 adicionado para a Lise enzimática. Isto aumentou a representação da LP na mesma amostra intestinal maior que duas vezes. O tratamento de lisozima garante a dissolução da camada externa enquanto o grânulo batendo passo facilita a lise do organismo. Otimização da quantidade de tecido, o tipo de grânulo de Granada e a duração das interrupções usando os grânulos são necessários para a obtenção de produtos de DNA ideais para realizar a análise PCR.
O impacto positivo dos probióticos administrados como profilaxia ou tratamento nos recém-nascidos pré-termo e termo é evidenciado em recentes estudos25,26,,27,28. O estabelecimento de um modelo de mouse neonatal adequado para probióticos é garantido para descompactar o efeito protetor de probióticos. Este protocolo descrito aqui representa um guia para os investigadores não familiarizados com o trabalho de rato neonatal usando probióticos. Não obstante os problemas com roedor microbiota enquanto estudava a doença e a saúde humana, esse método pode ser estendido para pesquisa focada em entender as mudanças da microbiome devido probióticos. Este modelo também fornece uma plataforma para estudar a interação do anfitrião-micróbio e respostas imunes ao longo dos diferentes estádios de desenvolvimento.
The authors have nothing to disclose.
Obrigado ao pessoal da facilidade de cuidado Animal e os veterinários UBC para treinamento e auxiliando o mouse funcionam no Instituto de pesquisa do Hospital infantil de BC. Graças a Universidade da Colúmbia Britânica e o departamento de Medicina Experimental para o estudo de financiamento.
1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |