מחקר זה מפרט את תהליך gavaging כמויות מדויקות של פרוביוטיקה לעכברים neonatal. הסידור ניסיוני אופטימלי כדי לכלול, אך אינה מוגבלת פרוביוטיקה מינון, שיטות ניהול, כימות של חיידקים במעיים.
מודלים העכבר למבוגרים היה בשימוש נרחב כדי להבין את המנגנון מאחורי התקדמות המחלה אצל בני אדם. תחולתה של מחקרים במודלים של העכבר למבוגרים מחלות neonatal הוא מוגבל. כדי להבין טוב יותר את התקדמות המחלה, המארח תגובות וההשפעה לטווח ארוך של התערבויות בתחום neonates, מודל העכבר neonatal סביר היא התאמה טובה יותר. השימוש העכבר neonatal מודלים דליל בחלקו ניתן לייחס את בעיות טכניות של עבודה עם חיות קטנות אלה. דגם העכבר neonatal פותחה כדי לקבוע את ההשפעות של פרוביוטיקה המינהל בחיים מוקדם, במיוחד להעריך את היכולת להקים מושבת העיכול העכבר היילוד. באופן ספציפי, כדי להעריך פרוביוטיקה קולוניזציה העכבר neonatal, לקטובצילוס plantarum (LP) נמסרה ישירות לתוך מערכת העיכול העכבר neonatal. לשם כך, LP היה מנוהל לעכברים מאכילים דרך הוושט-“אינטרה” gavage (IE). שיטה ישימה במיוחד פותחה כדי לתקנן את התהליך של IE gavage המאפשר ניהול מדויק של פרוביוטיקה במינונים תוך מזעור טראומה, היבט חשוב במיוחד בהתחשב השבריריות של עכברים היילוד. מגבלות של תהליך זה כולל אפשרויות של גירוי הוושט או נזק ואת השאיפה אם gavaged באופן שגוי. גישה זו מייצג שיפור על נוהלי הנוכחי כי IE gavage לתוך הוושט דיסטלי ומצמצמת את השאיפה. בעקבות gavage, לפרופיל קולוניזציה של פרוביוטיקה היה לעקוב אחריו באמצעות כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) של ה-DNA שחולץ מעיים עם תחל ספציפי LP. הגדרות המלטה שונים וטכניקות ניהול כלוב שימשו כדי להעריך את פוטנציאל קולוניזציה הכפולה. הפרוטוקול מפרט המורכבות של IE העכבר neonatal gavage ו קולוניזציה עוקבות כימות עם LP.
אצל תינוקות, שחשיפה מוקדמת פרוביוטיקה היה קשור עם אפקטים immunomodulatory שמוביל שכיחות מופחתת של מחלות כמו שדעתו enterocolitis, דלקת עור אטופית, אלח דם1,2,3, 4 , 5. עם זאת, המנגנון מאחורי תגובה immunomodulatory זו הוא מאתגר לחקור נתון המגבלה דגימה בניסויים בבני אדם הנולד (קרי, לקחת דם סדרתית, ביופסיות). מודלים neonatal העכבר יכול לעזור ללמוד מנגנון הפעולה המעורבים בוויסות המערכת החיסונית neonatal המשויך פרוביוטיקה לשימוש ושינויים microbiota מעיים. למרבה הצער, רוב הדגמים העכבר עבור מוצרי פרוביוטיקה התמקדו בעיקר על עכברים בוגרים; עם זאת, ההשפעה של פרוביוטיקה סביר להיות הגבוה ביותר בשלב מוקדם בחיים, מציע דגמים ספציפיים עבור קבוצת גיל זו תהיה שימושית3,6. בנוסף, העכבר neonatal מודלים מתאימים יותר ללמוד מחלות והתערבויות מיועדת עבור יישום בחיים מוקדם של תינוקות אנושיים הם צפויים לחקות באופן הדוק יותר בפיתוח מערכת החיסון ומערכת מיקרוביאלי7,8 9, ,10. המטרה הייתה לבחון במידה ואת דפוסי פרוביוטיקה מושבת עכברים neonatal עם דגש על האינטראקציה מכניסטית בין המארח לבין microbiome שלה. לא נמצאו מתאימים תיאורים של היילוד דגמים בספרות, ובכך צורך לפיתוח שיטה סטנדרטית ועמיד היה מיועד.
שיטות הוקמה מינהל אוראלי של תרכובות שונות לעכברים היילוד כוללות העברת אימהי של תרכובות הרצויה דרך חלב בטיפול מקור המים סכרים בהריון11 או באמצעות מחטים האכלה כדי להקל על הניהול של תרכובות הרצוי לתוך oropharynx12. שיטות אלה שימושיים עבור ניסויים שאין להן דרישות מינון מדויק, איפה הטיפול ברצון בליעתו על ידי העכבר הנמען. פרוביוטיקה ניתנת לעתים קרובות בשילוב עם prebiotic כגון galactooligosaccharide ו- fructooligosaccharide (פוס) המשמשים כמקור תזונה עבור חיידקים פרוביוטיים; תרכובות אלו מוספים להפוך את הפתרון צמיגה ומאתגר לנהל באמצעות למתודולוגיות הנ. להמציא שיטה לנהל כמויות מדויקות של פרוביוטיקה ו prebiotics עכברים היילוד מתחיל מוקדם היום הראשון של החיים (בארבי כוכ) שהיו נחוצות. פיתוח הטכניקה gavage, האפשרות של מושבת-התפשטות (כפי שנצפה במחקרים אחרים פרוביוטיקה בין הטיפול את בקרת נשק13,14,15,16) נבדקה שפע יחסי של להפקר plantarum לקטובצילוס (LP) במעיים של הגורים עם לוחות זמנים שונים gavage היה להעריך. הכנת פרוביוטיקה המשמשים את הניסויים כללה 109 המושבה יוצרי יחידות (CFU) לכל gavage של LP (בקרת האוויר-202195 זן), מעורבב עם פוס (prebiotic), מלטודקסטרין (excipient) כפי שמתואר הניסיון האנושי3האחרונים. המשלוח פרוביוטיקה הושג באמצעות IE gavage, התהליך זה מפורט להלן בפרוטוקול. לפרופיל קולוניזציה של פרוביוטיקה הוערך באמצעות הגברה בזמן אמת של DNA שחולצו מן המעיים שלם באמצעות תחל ספציפי LP.
ההליך של IE gavage פותחה בבטחה לתת מינון מסוים של פרוביוטיקה עכברים neonatal. כמויות קטנות של נוזל מועברות של מערכת העיכול העליונה באמצעות מחט האכלה כדי למנוע שאיפה תוך הקפדה על המסירה של המינון ביטחון. המעיים של העכברים שנאספו לשם קולוניזציה ניתוח שני ורשום שישה ימים gavage. ההליך להפקת DNA שונה כדי להבטיח תשואה גבוהה של האורגניזם גראם חיוביים פרוביוטיקה. ניתוח qPCR של ה-DNA חילצה יומיים פוסט האחרון gavage הראה גבוהים יחסית התיישבות LP בעכברים gavaged בכל יומיים לעומת עכברים gavaged כל יום בין בארבי כוכ 2-8. היה שם גם ירידה בכמות LP במשך שישה ימים, מציג זה פרוביוטיקה להיות אורגניזם ארעי במעיים של העכבר. התוצאות של ניסויים אלה נקבעו תנאים לערוך מחקר עם הקפדה גבוהה בקבוצת גיל זו.
כדי לבחון את ההשפעות ארוכות הטווח של פרוביוטיקה בעכברים neonatal, זה היה מנוהל לעכברים neonatal 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום; מועד התחלה דומה הצבע המשפט האנושי. האכלה הלוע התחתון של עכברים neonatal בעבר מתואר בספרות, בוצעה רק לאחר12,עוד לא יודעיםעליהם כלום 5-817 כאשר הסיכון של השאיפה הוא נמוך יותר בשל מכניקה הבליעה מפותח. עם זאת, האכלה הלוע התחתון אינה מתאימה עבור עכברים 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום כפי שיעור גבוה יותר של שאיפה נצפו במחקר פיילוט (נתונים לא מוצג). הטבע צמיגה של פרוביוטיקה, פתרון prebiotic הוסיף את הסיכון של השאיפה. בעקבות ההליך gavaging ‘ ב- IE ‘ למזער את הסיכון של השאיפה בעכברים 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום תוך אספקת לנפח הרצוי באופן ישיר מערכת העיכול העליונה. ההצלחה של הפרוצדורה אומתה תחילה באמצעות צבע מאכל חדורים פרוביוטיקה gavage. מאכל פועל כסמן הגלוי דרך העור של הכלבלב. אין השפעות שליליות נצפו עכברים gavaged עם צבע מאכל, מומלץ לאמת את ההליך gavaging באופן זה לפני התחלת ניסויים בקנה מידה גדול. פתרון מהיר gavage פוסט ראית רפלקס בקול מתנשף יכול לשמש גם מהווים אינדיקציה נוספת gavage מוצלח. ברגע העכבר מושם על השמיכה חימום פוסט-gavage, רפלקס בקול מתנשף יהיה להתפוגג ואתם עלייה בשכיחות נשימה יתקיימו בתוך 20 שניות. המשך רפלקס בקול מתנשף במשך יותר מ-30 שניות מציין gavage נכשל. Gavage מוצלחת תלויה גם המתאים החדרת המחט האכלה עם הנורה יושב מעל הפתח של הטבעת הלב של הקיבה. זה ניתן להקל על-ידי הבטחת כי הסימונים על המחט מדידת האורך בין הסרעפת קצה החוטם, לא לעבור החוטם של העכבר במהלך gavage. פעולה זו מקטינה את הסיכוי לפגיעה העכבר. התדירות של gavage יכול יש השפעה משמעותית על תוצאות הניסוי. Gavaging בתדירות גבוהה גם יכול ליצור יותר לחץ על הגורים והאם בשל ההפרעות מתמדת של הכלוב ואת הקן. ז gavage האופטימלי ביותר הוא כאשר gavages לפחות בתדירות גבוהה ומעל משך קצר יותר של זמן מבלי לאבד את האפקט הצפוי במערכת. כדי להבטיח את הבטיחות ואת עקרות של ההליך gavage את המחט חייב להיות מחוטא ע י כביסה ושימוש autoclaving שביניהם. כביסה בקפדנות על שימוש חיצוני קרצוף מבפנים על-ידי אילוץ מים דרך המחט באמצעות מזרק לפני autoclaving הכרחי כמו כל שאריות של חלקיקים יכול משובצים המחט במהלך autoclaving ואני יכול להתערב עם ההליך gavaging.
קולוניזציה LP גבוה יותר נצפתה ב הגורים היו gavaged כל יום בהשוואה הגורים gavaged כל יום. זה יכול להיות בגלל הלחץ מופחת על הגורים gavaged בכל יום נוספים ואפשרות של פרוביוטיקה מקבל חומרים מזינים יותר דרך החלב יחסית יותר על ידי הגורים. התלות במינון של פרוביוטיקה לטיפול נחקרה בעבר העכבר מודלים18,19 , ולכן חשוב הממשל של המינון הנכון. הפתרון פרוביוטיקה מוכן הוא מצופה לפני כל gavage כדי ספירה מדויקת של CFU מנוהל. אם האורגניזם פרוביוטיקה אנאירובית, חשוב לראות אם יש הבדל CFU כאשר תרבותי aerobically או anaerobically. מאחר LP אובליגטוריים עיצוב גבות, זה היה תרבותי באמצעות שתי השיטות, אין הבדל CFU נצפתה.
פוסט gavage מעיים LP עומס הניתוח בוצע באמצעות דגימות DNA qPCR, באיכות גבוהה. כדי לצמצם זיהום LP DNA בין הטיפול את קבוצות שליטה, שונה האכלה מחטים, ארונות אבטחה ציוד כירורגי שימשו כדי להבטיח דגימות באיכות הגבוהה ביותר. מדידת מדויק פרוביוטיקה במעי נדרש שיטת מיצוי DNA ממוטבת. השיטה היעילה ביותר להפקת DNA של צואה כרוך במספר חרוז להכות צעדים20,21,22. שיטה זו הייתה מאומצת על החילוץ של חיידקים במעיים באמצעות מכות חרוז והנצפית ייצוג מופחתת (< 10 עותקים2 התאושש) של LP ב הפקת דנ א כל המעי. כמו LP הוא אורגניזם גראם חיוביים עם כמות משמעותית של פפטידוגליקן בקיר התא, הפרוטוקול היה מותאם עם שלב ההמסה פפטידוגליקן באמצעות ליזוזים23,24 שנוספו למאגר פירוק אנזימטי. זה עלה הייצוג של LP במדגם מעיים אותו-גדול מכפולה. הטיפול ליזוזים מבטיח פירוק השכבה החיצונית בעוד החרוז להכות שלב מקלה את פירוק של האורגניזם. אופטימיזציה של כמות הרקמה, את סוג חרוז גארנט ואת משך הזמן של הפרעה באמצעות החרוזים הוא הכרחי עבור קבלת מוצרים DNA אופטימלית לערוך ניתוח ה-PCR.
ההשפעה החיובית של פרוביוטיקה מנוהל כמו טיפול מונע או טיפול ב neonates מראש טווח, המונח הוא שמעידים האחרונות מחקרים25,26,27,28. הקמת מודל ראוי העכבר neonatal פרוביוטיקה היא מוצדקת כדי לפרוק את ההשפעה המגנה של פרוביוטיקה. פרוטוקול זה שמפורטות כאן מייצג מדריך עבור חוקרים לא מוכר עם העכבר neonatal עבודה בעזרת פרוביוטיקה. על אף הבעיות עם מכרסמים microbiota תוך כדי לימוד מחלה ובריאות האדם, שיטה זו ניתן להרחיב את המחקר התמקד להבין את השינויים של microbiome עקב פרוביוטיקה. מודל זה מספק גם פלטפורמה ללמוד מארח-חיידק אינטראקציה, תגובות מערכת החיסון במהלך שלבים התפתחותיים שונים.
The authors have nothing to disclose.
תודה לצוות יחידת הטיפול חיה ו הוטרינרים UBC עבור הדרכה ועזרה העכבר עובד במכון מחקר לפנה ס לילדים החולים. הודות אוניברסיטת בריטיש קולומביה במחלקה לרפואה ניסויית למימון המחקר.
1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |