Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать, как представлять одоранты с низкой летучестью для регистрации одиночного сенсиллы у нейронов обонятельных рецепторов Drosophila, которые реагируют на длинноцепочечные кутикулярные феромоны.
Насекомые полагаются на их обоняние, чтобы вести широкий диапазон поведения, которые имеют решающее значение для их выживания, таких как поиск пищи, избегание хищников, откладка яиц и спаривание. Мириады химических веществ различной летучести были идентифицированы как естественные одоранты, которые активируют нейроны обонятельных рецепторов насекомых (ORNs). Однако изучение обонятельных реакций на низколетучие одоранты затруднялось неспособностью эффективно представлять такие стимулы с использованием обычных методов доставки запаха. Здесь мы описываем процедуру, которая позволяет эффективно представлять одуранты с низкой летучестью для записи одиночной чувствительности in vivo (SSR). Минимизируя расстояние между источником запаха и тканью-мишенью, этот метод позволяет применять биологически важные, но до сих пор недоступные одоранты, включая пальмитолеиновую кислоту, стимулирующий феромон, продемонстрированный эффект на ОРН, участвующих в ухаживании и спаривании 1 .Таким образом, наша процедура дает новый путь для анализа большого количества одорантов с низкой летучестью для изучения обоняния насекомых и обмена феромонами.
Drosophila ORN реагируют на огромное количество одорантов с широким диапазоном длин углеродных цепей и различными функциональными группами, включая сложные эфиры, спирты, кетоны, лактоны, альдегиды, терпены, органические кислоты, амины, соединения серы, гетероциклики и ароматические соединения 2 , 3 . Одоранты, различающиеся по своим физико-химическим свойствам, могут иметь заметно различную летучесть, определяемую давлением паров соединения. Примечательно, что биологически значимые одоранты для Drosophila melanogaster сильно отличаются от их летучести. Например, Ir92a ORN реагируют на аммиак 4 , который очень летучий, с давлением паров 6432 мм рт.ст. при 20 ° C. Напротив, OR67d ORN реагируют на мужской феромон, цис- ваккенилацетат ( c VA) 5 , 6 , давление паров которого составляет 43 мм рт. Ст. При 20 ° C.
Ove_content "> Изучение обонятельной реакции на одоранты с низкой летучестью особенно бросает вызов обычным способам доставки запаха, при которых одоранты доставляются через воздушный поток носителя на относительно большом расстоянии ( то есть в несколько сантиметров). Таким образом, сообщаемые обонятельные реакции К данному одоранту с низкой летучестью может сильно варьироваться в зависимости от конструкции системы доставки запаха. Например, сообщаемая реакция OR OR OR с высокой дозой c VA варьируется от ~ 40 7 -> 200 пиков / с 6 Более того, неэффективная доставка c VA с обычными методами доставки, вероятно, связана с ложноотрицательными результатами, что приводит к интерпретации того, что c VA сам по себе недостаточно для активации OR OR 8 8. Эта интерпретация была позже опробована другим исследованием, используя Близкий метод доставки запаха 9. ПоэтомуЧтобы разработать надежную систему доставки запаха для эффективного представления одорантов низкой волатильности.Недавно мы идентифицировали несколько длинноцепочечных кутикулярных жирных кислот в качестве лигандов для ORN OR47b. Они размещены в типе 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Среди оловян с длинноцепочечными жирными кислотами мы обнаружили, что пальмитолеиновая кислота функционирует как афродизиакский феромон, который способствует ухаживанию мужчин, активируя OR OR 1b 1 . Однако в другом исследовании, использующем традиционный способ доставки запаха, было показано, что метилмаурат вызывает реакции ORN ORsb, в то время как пальмитолеиновая кислота не вызывала реакции при представлении с того же расстояния 10 . По сравнению с c VA жирные кислоты с длинной цепью еще менее летучие, при давлении паров менее 0,001 мм рт.ст. при 25 ° C 11 . По своей природе низкая летучесть одинарных жирных кислот с длинной цепью, что препятствует эффективному представлению антенны черезОбычные системы доставки запаха, вероятно, учитывали ложноотрицательные результаты 10 . Эта несогласованность подчеркивает неадекватность традиционных систем доставки запаха при представлении одорантов с низкой летучестью. Ранее было показано, что эффективная подача кутикулярных запахов мух требует непосредственной близости между источником запаха и целевой тканью 6 . Таким образом, чтобы полностью охарактеризовать влияние биологически активных феромонов, одновременно имитируя расстояние, с которым они, вероятно, встречаются плодными мухами в природе 12 , 13 , мы согласились с тем, что минимальная дистанция должна быть в приоритетном порядке нашей процедурой.
Наш метод обладает дополнительными преимуществами, включая совместимость со стандартными электрофизиологическими установками и методами. Предварительно существующие установки буровых установок требуют минимальной модификации для соответствия этому протоколу, и большинство шагов SSR требуют лишь незначительных корректировок. ЭтаДелает нашу технику доступной для исследователей, имеющих опыт работы в ССР. Кроме того, наша методика позволяет представить низкоотражающие одоранты с острым началом и смещением, коррелируя доставку стимула с нейронным ответом. Наконец, аппаратная компоновка облегчает быстрый обмен между картриджами одорантов, ускоряет сбор данных в желаемом диапазоне дозировок.
Мы начнем с рассмотрения подготовки эталонных и регистрирующих электродов, раствора для взрослых Hemolymph-Like (AHL), картриджей для доставки одорантов и соответствующего ольфактометра. Затем мы обсудим приготовление растворов одорантов пальмитолеиновой кислоты с последующим приготовлением мухи для записи. Мы переходим к рассмотрению критериев выбора трихоидного сенсилума для записи и более тщательного изучения положения патрона одоранта перед представлением репрезентативных данных, полученных с использованием этого метода. Наконец, мы заключаем, исследуя полезные применения этого методаUe, некоторые возникающие проблемы и их решения.
Здесь мы описали процедуру, с помощью которой реакции OR47b ORN на пальмитолеиновую кислоту могут быть надежно индуцированы и записаны. Мы модифицировали традиционный метод доставки запаха на дальние расстояния 2 , 7 , 10 для устранения проб…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Е. Чжан за помощь с образцами следов и Тин Ки Цанг за помощь с картинками. Эта работа была поддержана премией Ранней карьеры Рэя Томаса Эдвардса и грантом NIH (R01DC015519) грантам C.-YS и NIH (R01DC009597 и R01DK092640) на JWW
Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Cartridge Materials | |||
200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Odorant Materials | |||
cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Rig Setup Materials | |||
Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
50x objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |