Het algemene doel van dit protocol is om aan te tonen hoe geurstoffen met lage volatiliteit voor single-sensillum-opname van Drosophila- olfactorische receptorneuronen kunnen optreden die reageren op lang-keten-cutulaire feromonen.
Insecten vertrouwen op hun reukzin om een breed scala aan gedragingen te leiden die kritisch zijn voor hun overleving, zoals voedselzoekende, roofdier vermijding, ovipositie en paring. Veelvoudige chemische stoffen met wisselende volatiliteiten zijn geïdentificeerd als natuurlijke geurstoffen die insectenolfactor Receptor Neurons (ORN's) activeren. Het bestuderen van de geurfactorische reacties op luchtspuiten met een laag volatiliteit is echter belemmerd door een onvermogen om dergelijke stimuli effectief aan te bieden door gebruik te maken van conventionele reukafleveringsmethoden. Hier beschrijven we een procedure die de effectieve presentatie van geurstoffen met een lage vluchtigheid toelaat voor in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). Door de afstand tussen de geurbron en het doelweefsel te minimaliseren, kan deze methode de toepassing van biologisch opvallende maar tot nu toe ontoegankelijke geurstoffen, waaronder palmitoolzuur, een stimulerende feromoon met een aangetoond effect op ORN's die betrokken zijn bij het hof en het paren gedrag 1 .Onze procedure biedt dus een nieuwe weg om een gastheer van lage-vluchtige geurstoffen te analyseren voor het bestuderen van insuline- en feromooncommunicatie.
Drosophila ORNs reageren op een groot aantal geurstoffen, met veel uiteenlopende koolstofketenslengten en een verscheidenheid aan functionele groepen, waaronder esters, alcoholen, ketonen, lactonen, aldehyden, terpenen, organische zuren, aminen, zwavelverbindingen, heterocyclische verbindingen en aromaten 2 , 3 . Geurstoffen die gevarieerd zijn in hun fysisch-chemische eigenschappen kunnen opmerkelijk verschillende volatiliteiten hebben, aangegeven door de dampdruk van de verbinding. Met name, biologisch relevante geurstoffen voor Drosophila melanogaster verschillen enorm in hun volatiliteit. Bijvoorbeeld reageren Ir92a ORN's op ammoniak 4 , die zeer vluchtig is, met een dampdruk van 6.432 mmHg bij 20 ° C. In tegenstelling hiermee reageren Or67d ORNs op een mannelijk feromoon, cis- va-acetaat ( c VA) 5 , 6 , waarvan de dampdruk 43 mmHg bij 20 ° C is.
Ove_content "> Het bestuderen van het olfactorische reactie op geurstoffen met een lage vluchtigheid is bijzonder uitdagend met conventionele geurafleveringsmethoden, waarbij geurstoffen via een dragerluchtstroom over een relatief lange afstand ( dwz enkele centimeter) worden afgeleverd. Als zodanig zijn de gerapporteerde olfactieve reacties Naar een gegeven volatiliteit geurmiddel kan sterk variëren, afhankelijk van het ontwerp van het geurafgifte-systeem. Bijvoorbeeld, de gerapporteerde respons van Or67d ORN's tot een hoge dosis c VA varieert van ~ 40 7 -> 200 spikes / s 6 . Bovendien is de ondoeltreffende levering van c VA met conventionele aflevermethoden waarschijnlijk toegeschreven aan valse negatieve resultaten, wat leidt tot de interpretatie die c VA op zichzelf niet volstaat om Or67d ORNs 8 te activeren. Deze interpretatie werd later uitgedaagd door een andere studie met behulp van een Luchtafgifte-methode 9. Het is dus imperaEen robuuste geurafleveringssysteem ontwikkelen voor de effectieve presentatie van geurstoffen met een lage vluchtigheid.Onlangs identificeerden we verscheidene lang-keten-cutulaire vetzuren als liganden voor Or47b ORN's. Ze zijn gehuisvest in het type 4 Antennale Trichoid Sensillum (at4). Onder de long-chain vetzuren geurstoffen, vonden we dat palmitolezuur functioneert als een afrodisiacale feromoon die mannelijke hofschap bevordert door Or47b ORNs 1 te activeren. In een andere studie die gebruik maakte van een gebruikelijke geurafleveringsmethode bleek methyllauraat echter reacties van Or47b ORNs op te wekken, terwijl palmitolezuur geen reactie opleverde bij dezelfde afstand 10 . Vergeleken met c VA zijn langzijdige vetzuren nog minder vluchtig, met dampdrukken minder dan 0.001 mmHg bij 25 ° C 11 . De inherente lage volatiliteit van long-chain vetzuur geurstoffen, waardoor de efficiënte presentatie van de antenne viaConventionele geurafleveringssystemen, die waarschijnlijk in aanmerking komen voor de valse negatieve resultaten 10 . Deze inconsistentie benadrukt de ontoereikendheid van conventionele geurafleveringssystemen bij het presenteren van laagvluchtige geurstoffen. Voorheen werd aangetoond dat de effectieve afgifte van vliegende kuticulaire geuren nauwe nabijheid vereist tussen de geurbron en het doelweefsel 6 . Om de effecten van biologisch actieve feromonen volledig te karakteriseren, terwijl ze de afstand waarna ze waarschijnlijk worden geconfronteerd met fruitvliegen in de natuur 12 , 13 , overeenstemmen, zijn we afgesproken dat minimale afstand in onze procedure een hoge prioriteit moet krijgen.
Onze methode bevat nog meer voordelen, waaronder compatibiliteit met standaard elektrofysiologie riggen en technieken. Pre-existing rig setups vereisen minimale aanpassing om dit protocol te behalen, en de meeste SSR-stappen vereisen slechts kleine aanpassingen. DezeMaakt onze techniek gemakkelijk toegankelijk voor onderzoekers die in SSR ervaren zijn. Bovendien staat onze techniek voor de presentatie van low-volatility odorants met een scherpe aanvang en offset, correlerende stimuluslevering met neuronale respons. Tenslotte vergemakkelijkt de hardware-indeling snelle uitwisseling tussen geurpatronen, waardoor gegevens verzamelen worden over een gewenst doseringsbereik.
We beginnen met het evalueren van de voorbereiding van referentie- en opnameelektroden, Volwassen Hemolymph-Like (AHL) -oplossing, Reukpatronen voor geurstoffen en de bijbehorende olfactometer. Vervolgens bespreken we de bereiding van de palmitolezuur-geuroplossingen, gevolgd door de voorbereiding van de vlieg voor opname. We gaan door naar de criteria voor het selecteren van een trichoid sensillum om de positionering van de geurcartridge te registreren en nauwkeuriger te onderzoeken alvorens de representatieve data die verkregen zijn met behulp van deze methode te presenteren. Tenslotte concluderen we nuttige toepassingen van deze techniekUe, sommige problemen, en hun oplossingen.
Hier beschrijven we een procedure waarbij de reacties van Or47b ORNs op palmitolezuur robuust kunnen worden geïnduceerd en opgenomen. Wij hebben een conventionele methode voor afgifte van lange afstand geur 2 , 7 , 10 aangepast om het probleem van onvoldoende feromoongeurstofafgifte te oplossen. We hebben de kwestie van vluchtige luikantilatiteit aangepakt door de verbinding via geurpatronen te leveren, waarvan de opening binn…
The authors have nothing to disclose.
We danken Ye Zhang voor de hulp met de voorbeeldsporen en Tin Ki Tsang voor de hulp met de foto's. Dit werk werd ondersteund door een Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award en een NIH-subsidie (R01DC015519) aan C.-YS en NIH subsidies (R01DC009597 en R01DK092640) aan JWW
Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Cartridge Materials | |||
200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Odorant Materials | |||
cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Rig Setup Materials | |||
Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
50x objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |