L'objectif global de ce protocole est de démontrer comment présenter des odorants de faible volatilité pour l'enregistrement à sens unique des neurones récepteurs olfactifs de Drosophila qui répondent aux phéromones cuticulaires à longue chaîne.
Les insectes dépendent de leur odorat pour guider un large éventail de comportements essentiels à leur survie, tels que la recherche d'aliments, l'évitement des prédateurs, l'oviposition et l'accouplement. Une myriade de produits chimiques de volatilité variable ont été identifiés comme des odeurs naturelles qui activent les neurones des récepteurs olfactifs d'insectes (ORN). Cependant, l'étude des réponses olfactives aux odorants à faible volatilité a été entravée par une incapacité à présenter efficacement ces stimuli en utilisant des méthodes classiques d'administration d'odeurs. Ici, nous décrivons une procédure qui permet de présenter efficacement des odorants à faible volatilité pour l'enregistrement in vivo solo-sensillum (SSR). En minimisant la distance entre la source d'odeurs et le tissu cible, cette méthode permet l'application d'odorants biologiquement salants mais inaccessibles jusqu'à présent, y compris l'acide palmitoléique, une phéromone stimulante ayant un effet démontré sur les ORN impliqués dans la parade et le comportement d'accouplement 1 .Notre procédure offre ainsi une nouvelle voie pour tester une foule d'odorants à faible volatilité pour l'étude de l'olfaction des insectes et de la communication de la phéromone.
Les ORN de Drosophila répondent à un grand nombre d'odorants, avec des longueurs de chaîne de carbone très variées et une variété de groupes fonctionnels, y compris les esters, les alcools, les cétones, les lactones, les aldéhydes, les terpènes, les acides organiques, les amines, les composés soufrés, les hétérocycliques et les aromatiques 2 , 3 . Les odeurs variées dans leurs caractéristiques physicochimiques peuvent avoir des volatilités nettement différentes, indiquées par la pression de vapeur du composé. Notamment, les odeurs biologiquement pertinentes pour Drosophila melanogaster diffèrent énormément de leur volatilité. Par exemple, les ORN Ir92a répondent à l'ammoniac 4 , très volatil, avec une pression de vapeur de 6,432 mmHg à 20 ° C. En revanche, les ORN Or67d répondent à une phéromone masculine, l'acétate de cis -acétate de vaccin ( c VA) 5 , 6 , dont la pression de vapeur est de 43 mmHg à 20 ° C.
Ove_content "> L'étude de la réponse olfactive aux odorants de faible volatilité est particulièrement difficile avec les méthodes classiques d'administration d'odeurs, dans lesquelles des odorants sont délivrés par un flux d'air porteur sur une distance relativement longue ( c.-à-d. Plusieurs centimètres). En tant que tel, les réponses olfactives rapportées À un odorant donné à faible volatilité peut varier considérablement selon la conception du système de distribution d'odeurs. Par exemple, la réponse signalée des ORN Or67d à une dose élevée de c VA varie de ~ 40 7 -> 200 pointes / s 6 . de plus, la fourniture inefficace des c VA avec les méthodes classiques d'administration est probablement attribuable à des résultats faussement négatifs, ce qui conduit à l'interprétation que c VA par elle – même pas suffisante pour activer Or67d Orns 8. Cette interprétation a été contestée plus tard par une autre étude utilisant un Méthode de livraison de l'odeur proche de la gamme 9. Il est donc imperaAfin de développer un système robuste d'administration d'odeurs pour la présentation efficace d'odorants de faible volatilité.Récemment, nous avons identifié plusieurs acides gras cuticulaires à longue chaîne comme ligands pour Or47b ORN. Ils sont logés dans le Sensillum Trichoid Antenal de type 4 (at4). Parmi les odorants d'acides gras à longue chaîne, nous avons constaté que l'acide palmitoleique fonctionne comme une phéromone aphrodisiaque qui favorise la parade masculine en activant Or47b ORN 1 . Cependant, dans une autre étude utilisant une méthode classique d'administration d'odeur, le laurate de méthyle a montré des réponses des ORN Or47b, alors que l'acide palmitoleique n'a suscité aucune réponse lorsqu'on a été présenté à la même distance 10 . Par rapport à c VA, les acides gras à longue chaîne sont encore moins volatils, avec des pressions de vapeur inférieures à 0,001 mmHg à 25 ° C 11 . La faible volatilité inhérente aux odeurs d'acides gras à longue chaîne, qui empêche une présentation efficace à l'antenne viaLes systèmes conventionnels d'odeur-livraison, ont probablement représenté les résultats faussement négatifs 10 . Cette incohérence souligne l'insuffisance des systèmes classiques d'administration d'odeurs dans la présentation d'odorants à faible volatilité. On a précédemment montré que la livraison efficace des odeurs cuticulaires à la mouche nécessite une étroite proximité entre la source d'odeurs et le tissu cible 6 . Ainsi, pour caractériser pleinement les effets des phéromones biologiquement actives tout en imitant la distance dont elles sont probablement rencontrées par les mouches des fruits dans la nature 12 , 13 , nous avons convenu que la distance minimale doit être hautement prioritaire dans notre procédure.
Notre méthode présente d'autres avantages, y compris la compatibilité avec les plates-formes et les techniques d'électrophysiologie standard. Les configurations de plates-formes préexistantes nécessitent une modification minimale pour tenir compte de ce protocole, et la plupart des étapes de SSR ne nécessitent que des ajustements mineurs. CeRend notre technique facilement accessible aux chercheurs expérimentés en SSR. En outre, notre technique permet la présentation d'odorants à faible volatilité avec un déclenchement et un décalage brusques, en corrélant la délivrance de stimulus avec la réponse neuronale. Enfin, la disposition du matériel facilite les échanges rapides entre les cartouches odorantes, accélère la collecte des données sur une gamme de dosage souhaitée.
Nous commençons par examiner la préparation des électrodes de référence et d'enregistrement, la solution de l'hémolymphe pour adultes (AHL), les cartouches d'administration d'odorant et l'olfactomètre correspondant. Nous discutons ensuite de la préparation des solutions d'odorant d'acide palmitoleique, suivies de la préparation de la mouche pour l'enregistrement. Nous examinons les critères de sélection d'un sensillum trichoïde pour enregistrer et examinons de plus près le positionnement de la cartouche odorante avant de présenter les données représentatives obtenues selon cette méthode. Enfin, nous concluons en explorant des applications utiles de cette techniqueCertains problèmes rencontrés et leurs solutions.
Ici, nous avons décrit une procédure par laquelle les réponses des ORS Or47b à l'acide palmitoleique peuvent être induites et enregistrées de manière robuste. Nous avons modifié une méthode conventionnelle de traitement des odeurs longue distance 2 , 7 , 10 pour dépanner le problème de l'apport insuffisant d'odorant à la phéromone. Nous avons abordé la question de la volatilité à faible teneur en ode…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Ye Zhang pour l'aide avec les traces d'échantillons et Tin Ki Tsang pour l'aide avec les images. Ce travail a été soutenu par un prix de carrière précoce de la Fondation Ray Thomas Edwards et une subvention NIH (R01DC015519) aux subventions de C.-YS et NIH (R01DC009597 et R01DK092640) à JWW
Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Cartridge Materials | |||
200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Odorant Materials | |||
cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Rig Setup Materials | |||
Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
50x objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |