Наиболее изученным аспектом биосовместимости стоматологических композитов является их цитотоксичность 3D CLSM промежуток времени визуализации в сочетании с флуоресцентной количественной сигнала позволяет чувствительную оценку судьбе клеток с течением времени. Используя этот метод может быть эффективным инструментом для оценки cytocompatibility стоматологических композитов.
Общепринято, что в пробирке клеток материалы взаимодействие является полезным критерием в оценке стоматологического материала биосовместимости. Целью данного исследования было использовать 3D CLSM времени визуализации промежуток конфокальной оценить биологическую совместимость в пробирке стоматологических композитов. Этот способ обеспечивает точное и чувствительное индикацию скорости жизнеспособной клетки в контакт с стоматологических композитных экстрактов. ELS дополнительная низкая усадка, зубной композит используется для прямого восстановления, было принято в качестве примера. В пробирке оценка была выполнена на культуре первичных человеческих десневых фибробластов с помощью Live / Dead окрашивание. Изображения были получены с конфокальной биологической перевернутой системе FV10i и проанализированы с FV10-ASW 3.1 Software. Анализ изображений показал очень незначительное цитотоксичность в присутствии тестируемого композита через 5 часов после промежутка времени. Небольшое снижение жизнеспособности клеток было показано в контакт с испытуемой композитного экстракты Comparред с контрольными клетками. Выводы подчеркнул важность использования 3D CLSM времени истечения изображений в качестве чувствительного метода качественно и количественно оценить поведение биосовместимость стоматологических композитов.
Одним из основных стандартов, цитируемых в рекомендациях ISO, чтобы определить биологическую совместимость является отсутствие токсичности материала в клетки. Смола на основе зубных композитов может выпустить компоненты из смолистой матрицы, которые могут быть первоначально из-за частичной полимеризации, и / или позже из-за процессов деградации с течением времени 1-4. Эти опубликованные компоненты вступают в контакт с тканями полости рта и может иметь различные недостатки, такие как крапивницы и слизистых реакций, 5 развитии аллергии и аллергических реакций у пациентов, 6 модификаций фибробласты десны морфологии и сокращения по типу белок коллаген I 7, иммуносупрессии или иммуностимуляции на митоген управляемом распространение очищенных Т-лимфоцитов и клеток селезенки 8 и повреждения ДНК в первичных фибробластов человека десны, которая подчеркивает их генотоксического потенциальную 9. Многие параметры могут повлиять зубной композитный токсичности, такие как тени сomposite, свет отверждения, химический состав мономера смолы, наполнитель и степень конверсии 10-13. Поскольку в пробирке токсичные свойства материалов могут предсказать, в естественных условиях ситуаций и можно сравнить с клинических ситуациях по изучению некоторых соответствующих конечных точек. Цитотоксичность стоматологических композитов и их компонентов были широко оценены с использованием культуры клеток системы 14- 16.
Эти системы в пробирке были разработаны с целью оценки дентальных композитов биосовместимость в срок: роста клеток, апоптоз клеток и с использованием ТНР-клеток, такие как 1monocytes 17, цитотоксичность в человеческих фибробластах десен 18, воспалительное потенциал в НаСаТ кератиноцитов как клетки 2, функциональности клеток odontoblast- как МЦОД-23 клеток 19, снижение общего уровня РНК и значительным увеличением индукции апоптоза на десны человека кератиноцитов 20 иПовреждение ДНК на десны и целлюлозно фибробластов 21.
Различные методики предложил исследовать биосовместимость стоматологических композитов. Колориметрические анализы, которые включают специфические красители и легкие измерения адсорбции, остаются наиболее широко используемым, из-за их относительной простотой и низкой стоимостью 22- 26. Анализ микроскопии с помощью световой отличие часто потребляет больше времени и берет на себя более высокие затраты. Тем не менее, эти методы микроскопии имеют несколько важных преимуществ. Наблюдение структуры клеток дает расширенную информацию о опытных токсических эффектов, обеспечивая тем самым более релевантные и конфиденциальных данных. В частности, введение конфокальной микроскопии позволило 27 для наблюдения биологических структур с осевой улучшения разрешения по сравнению с традиционными широко полевых флуоресценции изображений микроскопов. Следовательно, конфокальной изображения стал мощным исследовательским инструментом в различных областяхмедицинские и научные исследования. В отличие от электронных методов микроскопии, сканирующей конфокальной микроскопии дает возможность визуализировать различные компоненты клеток по включению специфических флуоресцентных маркеров. Большинство из этих конкретных индикаторов стабильны в водной среде, разумно измеримы, недорогой и нетоксичный 28, что позволяет использовать их в клинических, так и лабораторных исследований исследований. Кроме того, образец сушки и фиксации требуется для обычного анализа электронной микроскопии не является необходимым для временной промежуток визуализации конфокальной, таким образом, зависит от времени сбора также возможно на образцах. По сравнению с двумерных изображений, конфокальный принцип формирования изображения позволяет образец подповерхностной визуализацию и трехмерную реконструкцию структуре от различных полученных изображений глубины; которые приводят к более точные и более конструктивные детали 29, 30. Данное видео исследование является примером использования трехмерной покадровой Confocal лазерной сканирующей микроскопии (3D-CLSM) в сочетании с Live / Dead флуоресцентной маркировки и сигнала количественного как инновационный метод. Методика представлена в этой работе имеет то преимущество, что позволяет чувствительную оценки и покадровой изображений живых клеток без изменения оцениваемую клеточную структуру. Нет подготовка действий не требуется до конфокальной анализа. Ранее эта же окрашивание используется для оценки жизнеспособности культивируемых губчатой кости ядер 31, но без конфокальной покадровой следующем. Точно такая же процедура покадровой конфокальной была использована для оценки эритромицин время уничтожающие активность бактерий активного ила в зависимости от их типа Грама 32 с помощью специального бактерии Live / Dead окрашивание. Эти методы были недавно адаптированы и использованы для сравнения токсичность стоматологических композитов на основе метакрилата мономеров 11.
Поведение биосовместимости материала является наиболее необходимым условием параметр, чтобы быть оценены перед медицинского применения. Международные стандарты охватывают медицинских приборов ISO 10993 33 и, в частности стоматологических материалов ISO 7405 34. Отсутствие токсического воздействия на окружающие клетки является ключевым нормой в оценке биосовместимости таких материалов. Именно поэтому цитотоксичность тестирование имеет такое значение в оценке стоматологического материала биосовместимости 35 – 37. ISO предложил методы испытаний могут быть основаны на метаболической активности или целостности мембраны. Отдельные конечные точки должны следовать конкретные условия для ранжирования негативных последствий, вызванных испытательном материала, с тем, чтобы минимизировать время и стоимость анализов оценки. Нынешний метод исследования (3D конфокальной время визуализации промежуток) является целостность мембран на основе. Оценка цитотоксичности через эту конечную точку, кажется, быть ценным маркером клеток biocompaвости с проверенными материалами и это также ISO утвердил конечную точку. В пробирке тесты предназначены для определения того, как образец материала влияет конкретный тип клеток. Колориметрический МТТ-анализ первоначально был описан Mossman (1983) в качестве полезного метода для измерения цитотоксичности в пробирке и пролиферации клеток. Тест МТТ основан на конверсии в соли тетразолия кристаллов формазана активными клетками, определяющего активности митохондрий. Это может быть переведена на жизнеспособность скоростью 38. Гупта и сотрудники сообщили, что тест МТТ является наиболее широко используемым методом для измерения цитотоксичности композитных смол. Сукциндегидразы и щелочные фосфатазы ответы были также использованы для той же цели 39. Тем не менее, судьба клетки не могут последовать, так как МТТ требуется убивая клетки при каждом измерении временной точке. Для того, чтобы более тщательно контролировать поведение окрашенных клеток в данном исследовании, дипрямоугольник наблюдения живых клеток проводили, благодаря промежуток времени CLSM изображений в сочетании с коротким окрашивания протокола, автоматического анализа изображений и флуоресцентной количественной сигнала.
Стоматологические композиты приходят в тесном контакте с тканями полости рта, особенно десен и пульпы клеток. Фибробласты бы мишенью компонентов, выделяющихся из этих восстановительных композитов 40 – 41. Кроме того, несколько исследований выявили, что увековечил элементы и первичные клетки могут иметь различные клеточные ответы в контакте с биоматериалов. Первичные элементы оказались более подходящими для оценки биоматериалов эффекты 42. Это объясняет использование первичных человеческих десневых фибробластов в качестве модели клеточной для оценки цитотоксичности испытуемого стоматологической композита в текущем исследовании. Токсичность потенциал освобожденных веществ из стоматологического композита был широко изучен 43 – 44. Для того чтобы оценить тон цитотоксическое действие материалов, два контакта модели клетки могут быть выполнены. В прямой контакт модельной системе материал помещают непосредственно с клетками-мишенями в то время как в косвенном контакте системы, клеток-мишеней находятся в контакте с элюируется из биологических средах. В клинической практике и для восстановительных процедур, зубной композит помещают в косвенном контакте с тканей десны. По этой причине, в настоящее время экспериментальный протокол было сосредоточено на косвенном контакте с системой фибробласты десны человека (клеток в присутствии тестируемых композитных экстрактов). Как ранее сообщал Даля и сотрудниками, ответы цитотоксичности были ранжированы как тяжелая (<30%), умеренная (30-60%), незначительное (60-90%) или не-цитотоксических (> 90%), на основе деятельности в отношении к значения, полученные для управления 45. Таким образом, в соответствии с этом рейтинге и в свете полученных результатов (таблица 1), композитный ELS дополнительная низкая усадка может быть оценен как веру слегка цитотоксическое и показали сопоставимую поведение с контрольными клетками в течение всего периода времени истечения. Использование в точно такой же метод расследования, результаты этого исследования можно было бы сравнить с теми, о недавно опубликованном исследовании. ELS дополнительная низкая усадка композита продемонстрировали превосходную биосовместимость по сравнению с двумя ранее протестированных композитов, используемых для одной и той же клинического применения, что является прямым восстановление 11. Дальнейшие исследования по-прежнему необходимо установить более полный сравнение.
При определении того, какие цитотоксичности одобрить для конкретной конечной точки оценки, важно понимать, преимущества и недостатки каждого анализа. Основной целью конфокальной микроскопии является достижение 3-D архитектуру клеток и органов. Техника способна выявить не только поверхность образца, но также его недр. Протокол, описанный здесь подчеркивает использование 3D CLSM времени визуализации промежуток конфокальной, как СенсиМетод ный для оценки в пробирке биосовместимость поведение стоматологического композита. Тем не менее, для того, чтобы избежать ограничений, возникающих в этой работе, рабочие станции Антивибрационные могут быть использованы для того, чтобы позволить более стабильный и длительный изображений промежуток времени; настольный могли изолировать используется конфокальной системы от негативного воздействия, что колебания в лаборатории может привести. Кроме того, материалы, используемые в полости рта в идеале должно быть безвредным для тканей десны и не должны содержать вещества, которые могут привести к системной токсичности. В соответствии с методологией, используемой и результатов, полученных от данного исследования можно сделать вывод, что тестируемый композитный (ELS дополнительная низкая усадка) не цитотоксичным в настоящих условиях эксперимента. Поскольку метод CLSM может дать чутко начальную скорость жизнеспособных клеток, другие возможности могут быть предусмотрены для оценки более конечных точек. В частности, как это было недавно сообщила, что композитные мономеры воздействуют на клетки Четух активные формы кислорода (АФК) 46- 48, дальнейшее исследование, необходимые для оценки корреляции если между цитотоксичности сигнализации сетей и АФК. Будущее протокол может быть предназначен для одновременного оценить АФК (H 2 O 2 и / или O 2 – окрашивание) и отношение цитотоксичности (Live / мертвых окрашивание) с помощью времени визуализации промежуток CLSM.
The authors have nothing to disclose.
Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.
Olympus Fluoview FV10i | Olympus | Confocal microscope | |
O2/Co2 Incubator | Pnasonic | MCO 5M | Cell incubation |
Live/Dead® Kit | Invitrogen | MP 03224 | Stain |
ELS extra low shrinkage® | Saremco | Dental composite | |
DMEM medium | Sigma | D 6046 | Culture medium |
Trypsin | Sigma | T1426 | harvesting cells |
chamber slide system | PAA | 14220040X | Culture chamber |
penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | Cell culture |
Amphotericin B | PAA | P11-001 | Cell culture |
Foetal bovine serum | PAA | A11-101 | Cell culture |
Cell Counter | Merck Millipore | 00110230TP1 | Cell counting |