牙科用复合材料的生物相容性研究最多的方面是其细胞毒性三维CLSM时间推移成像结合的荧光信号的量化允许细胞命运的敏感性评价随时间。利用这种方法可能是一种有效的工具,以评估牙科复合材料的相容性。
人们普遍认为在体外的细胞物质的相互作用是在牙科材料的生物相容性评价一个有用的标准。本研究的目的是利用3D激光共聚焦显微镜时间推移共焦成像,以评估在体外生物相容性牙科复合材料。此方法提供了存活细胞率与牙科用复合提取物接触的精确和灵敏的指示。在ELS额外收缩率低,用于直接修复的牙科用复合材料,已被作为例子, 在体外评估用活/死细胞染色的原代培养的人牙龈成纤维细胞中进行。图像得到的FV10i共聚焦生物倒置制度,并与FV10-ASW 3.1软件进行分析。图像分析显示,在所测试的复合物的存在下,很轻微的细胞毒性5小时时间流逝之后。细胞活力略有下降与测试复合提取物对比例接触被证明ED控制单元。研究结果强调了利用3D激光共聚焦显微镜时间推移成像作为一个敏感的方法,定性和定量评价的牙科复合材料的生物相容性行为。
其中引用了ISO建议定义生物相容性的主要标准是缺乏物质毒性的细胞。基于树脂的牙科复合材料可释放从树脂基质组分,它可以是最初由于部分聚合,和/或购买由于降解过程随着时间的推移1-4。这些释放的部件接触到口腔组织接触,并且可以具有各种缺点像荨麻疹和粘膜反应5中,在患者6发展过敏和过敏性反应,牙龈成纤维细胞形态和还原上式改型I型胶原蛋白7,免疫抑制或免疫刺激对有丝分裂原驱动的扩散纯化的T淋巴细胞和脾细胞8和初级人牙龈成纤维细胞的DNA损伤,从而强调其潜在遗传毒性9。许多参数会影响牙科复合毒性,如C的荫omposite,光固化时,树脂单体的化学组成中,填料和转换10- 13度。自体外毒性的材料潜在可预测在体内的情况,并且可以相对于由相关的一些端点的研究的临床情况。牙科用复合材料和它们的组件的细胞毒性已使用细胞培养系统14-16广泛评价。
这些体外系统已被开发,以评估的术语牙科复合材料的生物相容性:细胞生长,并使用THP-1monocytes样细胞17细胞凋亡,细胞毒性中的人牙龈成纤维细胞18,抗炎潜力的HaCaT角质形成细胞样细胞2,细胞功能odontoblast-像MDPC-23细胞19,减少总RNA水平,以及在细胞凋亡的诱导对人牙龈的显著增加角化细胞20和对牙龈和牙髓成纤维细胞21的DNA损伤。
不同的方法被提出来探讨牙科复合材料的生物相容性。比色测 定法,其中涉及特定的着色剂和光吸收测量,仍然是最常用的,由于它们的相对简单性和成本22- 26低。通过光显微镜分析经常会消耗更多的时间,且需要更高的成本。然而,这些显微技术具有一些重要的优点。细胞结构的观察提供了关于经历的毒性作用的扩展信息,从而提供更相关和敏感数据。特别是,引入共聚焦显微镜27的已经允许用于生物结构的观测与改善轴向分辨率相比于传统的宽视场成像的荧光显微镜。因此,激光共聚焦成像已经成为不同领域的功能强大的调查工具医学和科学的研究。而相比之下,电子显微镜技术,共聚焦显微镜,提供通过特定的荧光标记物掺入到可视化细胞的不同的部件的能力。大多数这些具体示踪剂是稳定在含水环境中,明智地衡量,廉价和无毒性的28,从而允许其在临床上使用,以及实验室研究报告。此外,所需的常规的电子显微镜分析的样品干燥和固着没有必要为时间的经过共焦成像,从而依赖于时间的获取,也可以对样品。相比于二维成像,共焦成像原理使样品表面下的可视化和三维结构重建从不同得到的深度图像;这导致,更精确,更详细结构29,30,但本视频研究是利用三维时间流逝的C的示例onfocal激光扫描显微镜(3D-CLSM)结合活/死荧光标记和信号量化为一个创新的方法。在本文所提出的技术具有使活细胞的敏感性评价和延时成像而不改变评估的单元结构的优点。共聚焦分析之前不需要任何准备步骤。先前,相同的染色,以评估培养的松质骨芯31的存活力,但没有共焦时间推移以下。类似地,相同的时间推移共焦步骤,用于根据使用的特定的细菌活/死染色的革兰式32,以评估活性污泥的细菌红霉素时间-杀活性。这些方法近来已经适于和用于比较基于甲基丙烯酸酯单体11的牙科复合材料的毒性。
生物相容性材料的行为是最先决条件参数的医疗用途之前进行评估。国际标准涵盖医疗器械的ISO 10993 33和专门的牙科材料的ISO 7405 34。缺乏的毒性作用于周围的细胞是在这样的材料的生物相容性评价的关键标准。这就是为什么细胞毒性试验在牙科材料生物相容性35的评价如此重要– 37。了ISO建议的测试方法,可以基于代谢活性或膜完整性。选择的端点应遵循的排名,以减少时间和评估测定的成本由试验材料引起的不利影响的特定条件。调查当前方法(3D共焦时间推移成像)是一种基于膜的完整性。 通过这个端点的细胞毒性评价似乎是细胞biocompa的一个有价值的指标tibility与供试材料,也是ISO标准端点。 体外试验的目的是确定一种材料样品影响特定细胞类型。比色MTT法最初是由莫斯曼(1983)被描述为用于体外细胞毒性和细胞增殖的测量的有用方法。的MTT试验是基于四唑鎓盐转化成甲臜结晶活性的细胞,它决定线粒体活性。这可以通过存活率38进行翻译。 Gupta和合作者报道,MTT检测是最广泛使用的方法,用于测量复合树脂的细胞毒性。琥珀酸脱氢酶和碱性磷酸酶的反应也被用于相同的目的39。然而,命运的细胞不能跟进,由于MTT法要求在每个测量时间点杀死细胞。为了更密切地监测染色的细胞的行为在当前的研究中,二进行矩形观察活细胞,由于时间的推移激光共聚焦显微镜成像结合短协议染色,自动图像分析和荧光信号的量化。
牙科复合材料都与口腔组织,特别是牙龈和牙髓细胞紧密接触。成纤维细胞是从这些修复剂组合物40释放组分的靶– 41。此外,一些研究已经报道,永生化细胞和原代细胞可以具有与生物材料接触的不同的细胞反应。原代细胞被认为是评估生物材料的影响42更合适。这解释了使用初级人牙龈成纤维细胞作为细胞模型在本研究中所测试的牙科用复合材料的细胞毒性的评估。从牙科复合释放物质的毒性潜力已被广泛研究43 – 44。为了评估吨他的细胞毒性的材料的潜力,两个接触模型细胞可以被执行。在直接接触的模型系统的材料直接置于与靶细胞,而在间接接触系统中,靶细胞是在与来自生物介质洗脱物接触。在临床上的应用程序和用于恢复过程,牙科用复合被放置在与牙龈组织间接接触。出于这个原因,目前的实验方案集中在间接接触系统的人牙龈成纤维细胞上(细胞在测试的复合提取物的存在下)。如先前所报道的达尔和合作者,细胞毒性应答列为基础的活性相对于对重度(<30%),中度(30-60%),轻微(60-90%)或无细胞毒性的(> 90%)获得控件45的值。因此,根据该排名,并在所得结果的光( 表1),复合的ELS额外低收缩可列为版本Ÿ略有毒性,并显示相媲美的行为在整个时间间隔期来控制细胞。使用精确相同的调查方法,这项研究的结果可能比那些最近发表的研究报告。相比于用于相同的临床应用,它是直接恢复11两个先前测试的复合材料在ELS额外低收缩复合证实优越的生物相容性。进一步的研究还需要建立更全面的比较。
当决定批准用于特定端点评估其细胞毒性测定,理解的优点,每个测定法的限制是重要的。共焦成像的主要目的是实现细胞和器官的3-D结构。该技术是能够揭示不仅检体的表面上,而且它的表面下。本文所描述的协议强调了利用三维CLSM时间推移共焦成像,作为森西略去方法来评估牙科复合材料的体外生物相容性行为。然而,为了避免在这项工作中所遇到的限制,抗振动的工作站可以以允许更稳定和更长的时间推移成像使用;桌面可以分离使用共聚焦系统的不利影响,在实验室中的振动可能会导致。此外,要使用在口腔中的材料应理想地是无害的牙龈组织,并应含有不物质,可能引起全身毒性。根据所使用的方法,并从当前的研究中获得的结果,可以得出结论,测试复合物(ELS的额外低收缩率)不是在本实验条件下的细胞毒性。作为CLSM方法能够灵敏地给活细胞的初始速率,其他的可能性可以预见,以评估多个端点。特别是,因为它已被最近报道,复合单体影响细胞苏氨酸ough活性氧(ROS)的46- 48,进一步的研究是必要的,以评估的相关性(如果有)的细胞毒性之间的信令网络和ROS产生。未来的协议可以被设计成同时评估ROS的产生(H 2 O 2和/或O 2 –染色),并使用时间的推移激光共聚焦显微镜成像的细胞毒性比(活/死染色)。
The authors have nothing to disclose.
Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.
Olympus Fluoview FV10i | Olympus | Confocal microscope | |
O2/Co2 Incubator | Pnasonic | MCO 5M | Cell incubation |
Live/Dead® Kit | Invitrogen | MP 03224 | Stain |
ELS extra low shrinkage® | Saremco | Dental composite | |
DMEM medium | Sigma | D 6046 | Culture medium |
Trypsin | Sigma | T1426 | harvesting cells |
chamber slide system | PAA | 14220040X | Culture chamber |
penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | Cell culture |
Amphotericin B | PAA | P11-001 | Cell culture |
Foetal bovine serum | PAA | A11-101 | Cell culture |
Cell Counter | Merck Millipore | 00110230TP1 | Cell counting |