치과 복합 재료의 생체 적합성 연구의 대부분의 측면은 형광 신호의 정량화와 결합 된 세포 독성 3D CLSM 시간 경과 영상은 시간이 지남에 따라 세포의 운명의 민감한 평가할 수있다. 이 방법을 활용하여 치과 복합 재료의 cytocompatibility을 평가하는 효율적인 도구가 될 수 있습니다.
그것은 일반적으로 시험 관내 세포 물질의 상호 작용은 치과 용 재료, 생체 적합성의 평가 기준이 유용한 것을 허용한다. 이 연구의 목적은 치과 복합 재료의 생체 외 생체 적합성을 평가하기 위해 3D CLSM의 시간 경과 공 촛점 이미징을 사용하는 것이 었습니다. 이 방법은 치과 복합 추출물과 접촉 생존 세포 비율의 정확하고 민감한 표시를 제공한다. ELS 여분의 낮은 수축, 직접 복원에 사용되는 치과 복합체는, 예를 들어 촬영되었습니다. 시험관 평가는 라이브 / 죽은 염색을 사용하여 배양 주 인간 치은 섬유 아세포에서 수행되었다. 이미지는 FV10i 공 초점 생물학적 반전 시스템으로 얻은 FV10-ASW 3.1 소프트웨어로 분석 하였다. 이미지 분석은 시간 경과 5 시간 후에 시험 복합체의 존재 하에서 아주 약간의 세포 독성을 보였다. 세포 생존의 약간의 감소는 시험 복합 추출 비교 예와의 접촉에 나타내었다에드 셀을 제어 할 수 있습니다. 결과는 정 성적 및 정량적으로 치과 복합 재료의 생체 적합성을 평가하기위한 동작 감지 방법으로서 3D CLSM 시간 경과 이미징의 사용을 강조.
생체 적합성을 정의하는 ISO 권고에 인용 주요 표준 중 하나는 세포 독성 물질의 부재이다. 수지 기반 치과 복합 시간이 1-4 이상 및 / 또는 이상에 의한 분해 과정에 대한 부분 중합 초기에 기인 할 수있는 수지 매트릭스의 구성 요소를, 공개 할 수 있습니다. 이 발표 구성 요소는 구강 조직에 접촉 및 두드러기 및 점막 반응 5 명 6 알레르기 및 과민 반응의 개발, 미토 겐에 유형에 대한 치은 섬유 아세포의 형태와 감소의 수정 I 콜라겐 단백질 (7), 면역 억제 또는 면역 자극 같은 다양한 단점을 가질 수있다 자신의 유전 독성 가능성 (9)을 강조 정제 T 림프구 및 비장 세포 (8) 및 기본 인간 치은 섬유 아세포의 DNA 손상 구동 형 확산. 대부분의 매개 변수는 C의 그늘로 치과 복합 독성에 영향을 미칠 수omposite, 광 경화 수지 단량체의 화학 성분, 충전제 및 전환 10- (13)의 정도. 재료의 시험 관내 독성 생체 전위 상황에서 예측할 수 있고, 일부 관련 엔드 포인트의 연구에 의해 임상 적 상황과 비교 될 수 있기 때문에. 치과 복합 재료 및 그 구성 요소의 세포 독성 널리 세포 배양 시스템 14- (16)으로 평가하고 있었다.
이러한 체외 시스템의 용어에 치과 복합 생체 적합성을 평가하기 위해 개발되었다 : 세포 성장, 세포 사멸 세포 (17)와 같은 THP-1monocytes를 사용하여, 인간 치은 섬유 아세포 (18)의 세포 독성, HaCaT에 염증 가능성이 세포 2, 세포 기능처럼 각화 odontoblast- MDPC-23 세포 (19), 총 RNA 수준의 감소, 인간 치은에 세포 사멸 유도에 크게 증가처럼 각화 20치은 및 펄프 섬유 아세포 세포 (21)에 대한 DNA 손상.
다른 방법은 치과 복합 재료의 생체 적합성을 조사하기 위해 제안된다. 특정 착색제 및 광 흡착 측정을 포함 비색 분석법, 그들의 상대적인 단순성 및 저가 22- 26, 가장 일반적으로 사용 남아있다. 광에 의한 콘트라스트 현미경 분석은 종종 더 많은 시간을 소비하며 비용 증가를 초래한다. 그러나 이러한 현미경 기술은 몇 가지 중요한 장점이있다. 셀 구조의 관찰하여보다 적절하고 중요한 데이터를 제공, 경험 독성 효과에 대한 확장 정보를 제공합니다. 특히, 공 초점 현미경 (27)의 도입은 기존의 와이드 필드 이미징 형광 현미경에 비해 축 방향의 해상도를 향상시키는 생물학적 구조의 관찰을 허용했다. 따라서, 공 초점 이미징의 다양한 분야에서 강력한 조사 도구가되었습니다의료 및 과학 연구. 전자 현미경 기술과 대조적으로, 스캐닝 공 초점 현미경은 특정 형광 마커의 혼입에 의해 세포의 별개의 구성 요소를 시각화 할 수있는 능력을 제공한다. 이들 특정 트레이서 대부분 임상에서 사용뿐만 아니라 실험실 연구 연구를 허용, 수성 환경에서 안정한 띌 측정, 저렴하고 28 무독성이다. 또한, 종래의 전자 현미경 분석에 필요한 시료 건조 및 고정 시간 경과 촛점 이미징을위한 필요가없고, 따라서 시간에 따라 획득 된 샘플에 또한 가능하다. 이차원 촬상에 비해 공 촛점 촬상 원리 시편 지하 시각화 및 상이한 깊이 얻어진 이미지에서 입체 구조의 재구성을 가능하게; 초래되는, 더 정확하고 더 세부 구조 (29), (30). 본 연구는 비디오 입체 타임 랩스 C의 사용의 예이다혁신적인 방법으로 라이브 / 죽은 형광 표지 및 신호 정량화와 결합 onfocal 레이저 스캐닝 현미경 (3D-CLSM). 이 논문에서 제시된 기술은 평가 된 셀 구조를 변경하지 않고 생균의 민감한 평가 및 시간 경과 이미징을 가능하게하는 장점을 갖는다. 어떤 준비 단계는 공 초점 분석하기 전에 필요하지 않습니다. 이전에는, 동일한 염색 배양 해면골 코어 (31)의 가능성을 평가하기 위해 다음의 촛점하지만 경과하지 않고 사용 하였다. 마찬가지로 동일한 시간 경과 촛점 절차 / 특정 박테리아 라이브 죽은 염색법을 사용하여 그람 형태 32에 따른 활성 슬러지의 박테리아 에리스로 시간 – 명 활성을 평가하는데 사용 하였다. 이들 방법은 최근에 적응 및 메타 크릴 레이트 단량체 11에 기초 치과 복합 독성을 비교하기 위해 사용되어왔다.
생체 적합성 물질의 동작은 의료용으로 평가하는 가장 필수 파라미터이다. 국제 표준은 의료 기기 ISO를 10993 33 특히 치과 재료 ISO 7405 (34)를 커버한다. 주변의 세포 독성 효과의 부재는 재료의 생체 적합성 평가의 핵심 표준이다. 37 – 세포 독성 시험은 치과 재료의 생체 적합성 (35)의 평가에서 이러한 중요성을 가지고 이유입니다. ISO 테스트 방법은 신진 대사 활동 또는 막 무결성을 기반으로 할 수 있습니다 제안했다. 선택된 엔드 포인트는 시간과 평가 분석의 비용을 최소화하기 위해 시험 물질에 의해 유발 된 부작용의 순위에 대한 구체적인 조건을 따라야한다. 조사의 현재 방법 (3D 공 촛점 시간 경과 영상)을 기반으로 막 무결성. 이 엔드 포인트를 통해 세포 독성 평가는 세포 biocompa의 중요한 지표가 될 것으로 보인다테스트 자료와 그것이 가진 tibility 또한 ISO는 엔드 포인트를 승인했다. 시험관 시험 물질 샘플이 특정 세포 유형에 영향을 미치는 방법을 결정하기 위해 설계되었습니다. 비색 MTT 분석은 원래 시험 관내 세포 독성 및 세포 증식의 측정에 유용한 방법으로서 (1983) 모스맨 의해 설명 하였다. MTT 시험 미토콘드리아 활성을 결정 활성 셀에 의해 포르 마잔 결정으로 테트라 졸륨 염 변환에 기초한다. 이것은 생존률 (38)에 의해 번역 될 수있다. 굽타 및 공동 작업자 MTT 시험 복합 수지의 세포 독성을 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이다보고. 숙신산 탈수소 효소 알칼리성 포스파타제 및 응답은 또한 동일한 목적 (39)을 위해 사용되어왔다. MTT 분석법은 각 측정 시점에서 세포를 죽이는 필요하기 때문에, 세포의 운명, 추적 할 수 없다. 현재 연구에서 더욱 밀접하게 염색 된 세포의 동작을 모니터링하기 위해, 다이에살아있는 세포의 RECT 관찰, 짧은 프로토콜 염색, 자동 이미지 분석 및 형광 신호의 정량화와 함께 시간 경과 CLSM 영상 덕분 하였다.
치과 복합 재료는 구강 조직, 특히 잇몸과 치수의 세포에 밀착되어 있습니다. 41 – 섬유 아 세포는 이러한 회복 복합 재료 (40)로부터 방출 구성 요소의 대상이 될 것입니다. 또한, 여러 연구는 불후의 세포 및 일차 전지는 생체 물질과 접촉하는 다른 세포 반응이있을 수 있다고보고있다. 일차 세포는 생체 물질 (42) 효과를 평가하기 위해 더 적절한 것으로 밝혀졌다. 이것은 현재 연구에서 시험 치과 복합체의 세포 독성 평가를위한 세포 모델로서 일차 인간 치은 섬유 아세포 세포의 사용을 설명한다. 44 – 치과 복합체로부터 방출 물질의 독성 전위는 43 널리 검토되고있다. t를 평가하기 위해서그 물질의 잠재적 인 세포 독성, 두 콘택트 모델 셀은 수행 될 수있다. 간접 접촉 시스템에서, 세포 생물학 미디어에서 용출과 접촉하는 동안 대상 직접 접촉 모델 시스템에서 물질을 직접적으로 표적 세포로 배치된다. 임상 적용 및 회복 절차, 치과 복합은 치은 조직과 간접 접촉에 배치됩니다. 이러한 이유로, 현재의 실험 프로토콜 (시험 복합 추출물의 존재하에 세포) 인간 치은 섬유 아세포와 간접 접촉 시스템에 집중 하였다. 이전 달과 공동으로 보도 된 바와 같이, 세포 독성 반응은에 활동 기준에 따라 <(90 %), (30 % 중간 (30~60%), 약간 (60~90%) 또는 비 세포 독성)> 심한 위를 차지했다 값은 컨트롤 (45)에 대한 취득. 따라서, 얻어진 결과의 빛 (표 1)이 순위에과에 따라, 복합 ELS 여분의 낮은 수축 VER로 선정 될 수있다Y는 약간 세포 독성 및 전체 시간 경과 기간 동안 세포를 제어하는 비교 동작을 나타내었다. 정확하게 동일한 방법을 이용하여 조사, 본 연구의 결과는 최근 발표 된 연구와 비교 될 수있다. ELS 여분의 낮은 수축 복합은 직접 복원 11 같은 임상 응용 프로그램에 사용되는 두 개의 이전에 테스트 복합 재료에 비해 우수한 생체 적합성을 보여 주었다. 추가적인 연구는 더욱 완전한 비교를 설정할 필요하다.
특정 종말점 평가를 승인하는 세포 독성 분석을 결정할 때, 그 장점과 각 분석의 한계를 이해하는 것이 중요하다. 공 촛점 이미지의 주된 목적은 세포 및 기관의 3-D 구조를 달성하는 것이다. 이 기술은 시료의 표면뿐만 아니라, 그 표면 아래뿐만 아니라 공개 할 수있다. 본원에 기재된 프로토콜은 SENSI로서, 3D CLSM 시간 경과 촛점 이미징의 사용을 강조적인 방법은 치과 복합 체외 생체 적합성 동작을 평가한다. 그러나,이 연구에서 발생 한계를 피하기 위해, 진동 방지 워크 스테이션은보다 안정적이고 장시간 경과 이미징을 허용하기 위해 사용될 수있다; 탁상용 실험실에서 진동이 발생할 수 있음 해로운 영향에서 사용 된 공 초점 시스템을 분리 할 수 있습니다. 또한, 재료는 이상적으로 치은 조직에 무해해야한다 구강에 사용되는 전신 독성을 일으킬 수있는 물질이 포함되어야합니다. 사용 방법에 따라서, 현재의 연구에서 얻은 결과 그것은 테스트 복합체 (ELS 여분 낮은 수축율) 본 실험 조건에서 세포 독성이되지 않는다는 결론을 내릴 수있다. CLSM 방법 민감 생존 세포의 초기 속도를 제공 할 수 있듯이, 다른 가능성은 더 많은 엔드 포인트를 평가하기 위해 예상 될 수있다. 특히, 최근보고 된 바와 같이 합성 모노머 THR 세포에 영향을 미친다깨닫지 못하고 있거나 남의 반응성 산소 종 (ROS) 46- (48)가, 추가 조사는 세포 독성 사이는 네트워크 및 ROS 생성을 시그널링하는 경우 상관 관계를 평가하기 위해 필요하다. 미래의 프로토콜을 동시에 ROS 생산을 평가하기 위해 (H 2 O 2 및 / 또는 O 2 – 염색) 설계 될 수 있으며, 시간 경과 CLSM 영상을 사용하여 세포 독성 비 (라이브 / 죽은 염색).
The authors have nothing to disclose.
Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.
Olympus Fluoview FV10i | Olympus | Confocal microscope | |
O2/Co2 Incubator | Pnasonic | MCO 5M | Cell incubation |
Live/Dead® Kit | Invitrogen | MP 03224 | Stain |
ELS extra low shrinkage® | Saremco | Dental composite | |
DMEM medium | Sigma | D 6046 | Culture medium |
Trypsin | Sigma | T1426 | harvesting cells |
chamber slide system | PAA | 14220040X | Culture chamber |
penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | Cell culture |
Amphotericin B | PAA | P11-001 | Cell culture |
Foetal bovine serum | PAA | A11-101 | Cell culture |
Cell Counter | Merck Millipore | 00110230TP1 | Cell counting |