O aspecto mais estudado da biocompatibilidade dos compósitos é sua citotoxicidade MCVL 3D de imagens de lapso de tempo combinado com quantificação sinal fluorescente permite uma avaliação sensível do destino das células ao longo do tempo. Utilizando este método pode ser uma ferramenta eficiente para avaliar a citocompatibilidade de compósitos odontológicos.
Aceita-se geralmente que a interacção no material celular in vitro é um critério útil na avaliação da biocompatibilidade de material dentário. O objetivo deste estudo foi utilizar MCVL 3D lapso de tempo confocal de imagem para avaliar a biocompatibilidade in vitro de compósitos odontológicos. Este método fornece uma indicação precisa e sensível da taxa de células viáveis em contacto com extractos de compósitos dentários. O ELS extra baixa retração, um compósito odontológico usado para restauração direta, tem sido tomado como exemplo. Avaliação in vitro foi realizado em células humanas em cultura primária de fibroblastos gengivais usando coloração Live / Morto. As imagens foram obtidas com o sistema biológico FV10i confocal invertido e analisados com o software 3.1 FV10-ASW. A análise da imagem mostrou uma citotoxicidade muito ligeira na presença do composto testado depois de 5 horas de tempo decorrido. Uma ligeira diminuição da viabilidade celular foi mostrado em contacto com o composto testado extractos compared com células de controlo. As descobertas destacou o uso de MCVL 3D lapso de tempo de imagem como um método sensível para avaliar qualitativa e quantitativamente o comportamento biocompatibilidade dos compósitos odontológicos.
Uma das principais normas citadas nas recomendações ISO para definir biocompatibilidade é a ausência de material de toxicidade para as células. À base de resina compósitos odontológicos podem liberar componentes da matriz resinosa, que poderia ser inicialmente devido a polimerização parcial, e / ou mais tarde devido a processos de degradação ao longo do tempo 1-4. Esses componentes liberados entrar em contacto com os tecidos orais e pode ter vários inconvenientes, como urticária e reações da mucosa 5, o desenvolvimento de alergias e reacções de hipersensibilidade em pacientes 6, modificações de fibroblastos gengivais morfologia e redução de colágeno tipo I de proteína 7, imunossupressão ou imunoestimulação em mitógeno -driven proliferação de linfócitos T purificados e células do baço 8 e danos no DNA de fibroblastos gengivais humanos primários, o que sublinha o seu potencial genotóxico 9. Muitos parâmetros podem afetar a toxicidade composta dental, como a sombra da composite, a cura pela luz, a composição química do monómero de resina, o material de enchimento e do grau de conversão de 10- 13. Desde in vitro potencial tóxico de materiais pode prever em situações in vivo e poderia ser comparado a situações clínicas pelo estudo de alguns parâmetros pertinentes. A citotoxicidade dos compósitos e os seus componentes foram amplamente avaliados utilizando sistemas de cultura de células 14- 16.
Estes sistemas in vitro têm sido desenvolvidos para avaliar a biocompatibilidade de compósitos dentários em termos de: o crescimento celular e a apoptose de células THP-1monocytes utilizando como células 17, citotoxicidade em fibroblastos gengivais humanos 18, potencial inflamatório em queratinócitos HaCaT 2, como as células da funcionalidade das células odontoblast- como MDPC-23 células 19, redução dos níveis de RNA total, e aumento significativo na indução de apoptose em gengival humano queratinócitos 20 eDanos no DNA em fibroblastos gengivais e polpa células 21.
Diferentes metodologias são sugeridas para investigar a biocompatibilidade dos compósitos odontológicos. Ensaios colorimétricos, que envolvem corantes específicos e medidas de adsorção de luz, continuam a ser o mais utilizado, devido à sua relativa simplicidade e baixo custo de 22 a 26. Análise de microscopia por contraste de luz com frequência consome mais tempo e incorre em custos mais elevados. No entanto, estas técnicas de microscopia tem algumas vantagens importantes. A observação da estrutura celular dá informações estendidas sobre efeitos tóxicos experientes, fornecendo assim dados mais relevantes e sensíveis. Em particular, a introdução de microscopia confocal 27 permitiu a observação de estruturas biológicas com a melhoria da resolução axial em relação a todo o campo microscópios de fluorescência imagiologia tradicionais. Assim, imagem confocal tornou-se um poderoso instrumento de investigação em diferentes áreas depesquisas médicas e científicas. Em contraste com as técnicas de microscopia electrónica, microscopia confocal de varrimento oferece a capacidade de visualizar os componentes distintos de células por incorporação de marcadores fluorescentes específicos. A maioria destes marcadores específicos são estáveis em um ambiente aquoso, de forma sensata mensurável, barato e não tóxico 28, permitindo a sua utilização em clínica, bem como estudos de investigação de laboratório. Além disso, a secagem e a fixação da amostra necessária para a análise de microscopia electrónica convencional, não é necessário para lapso de tempo de imagiologia confocal, aquisição, assim, dependente do tempo, também é possível em amostras. Em comparação com a imagem bidimensional, o princípio de imagem confocal permite uma visualização exemplar do subsolo e reconstrução da estrutura tridimensional das diferentes imagens de profundidade obtidos; detalhes que resultam em, mais precisos e mais estruturais 29, 30. O estudo de vídeo atual é um exemplo do uso de tridimensional Time-Lapse Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-MCVL) combinado com uma rotulagem Vivo / Dead fluorescente e quantificação de sinais como um método inovador. A técnica apresentada neste trabalho tem a vantagem de permitir a avaliação e time-lapse de imagens sensíveis de células vivas, sem alterar a estrutura celular avaliado. Não há etapas de preparação são necessários antes da análise confocal. Anteriormente, a mesma coloração foi utilizada para avaliar a viabilidade da cultura núcleos de osso esponjoso 31, mas sem confocal time-lapse seguinte. Da mesma forma o mesmo procedimento de lapso de tempo confocal foi utilizado para avaliar a eritromicina atividade tempo de morte em bactérias de lodo ativado de acordo com o seu tipo Gram 32 usando uma bactéria específicos Viva / coloração mortos. Estes métodos foram recentemente adaptado e utilizado para comparar a toxicidade de compósitos dentários baseados em monómeros de metacrilato de 11.
Comportamento do material biocompatibilidade é o parâmetro mais pré-requisito para ser avaliado antes de uso médico. As normas internacionais cobrir dispositivos médicos ISO 10993 33 e, especificamente, materiais dentários ISO 7405 34. A ausência de efeitos tóxicos para as células vizinhas é a norma fundamental na avaliação da biocompatibilidade desses materiais. É por isso que a análise da citotoxicidade tem tanta importância na avaliação de material odontológico biocompatibilidade 35-37. A ISO sugeriu métodos de ensaio pode ser baseada em atividade metabólica ou a integridade da membrana. Terminais seleccionados devem seguir as condições específicas para a classificação de efeitos adversos induzidos por um material de teste, a fim de minimizar o tempo e o custo dos ensaios de avaliação. O método atual de investigação (3D tempo confocal lapso de imagem) é a integridade da membrana baseado. A avaliação da citotoxicidade através deste parâmetro parece ser um marcador válido para biocompa celulartibilidade com materiais testados e é também ISO aprovado endpoint. Testes in vitro são projetados para determinar como uma amostra de material afeta um tipo particular de célula. O ensaio colorimétrico MTT foi originalmente descrito por Mossman (1983) como um método útil para a medição da citotoxicidade in vitro e a proliferação celular. O ensaio MTT baseia-se na conversão do sal de tetrazólio em cristais de formazano por células activas, que determina a actividade mitocondrial. Isso pode ser traduzido por taxa de viabilidade 38. Gupta e colaboradores relataram que o teste MTT é o método mais amplamente utilizado para medir a citotoxicidade das resinas compostas. Succínico desidrogenase e respostas de fosfatase alcalina também têm sido utilizados para o mesmo fim 39. No entanto, as células de destino não pode ser seguido para cima, uma vez que o ensaio MTT requer matando as células em cada ponto de tempo de medição. A fim de acompanhar mais de perto o comportamento das células coradas no estudo atual, diobservação rect de células vivas foi realizado, graças ao tempo de imagem lapso MCVL combinado com uma pequena mancha de protocolo, análise de imagem automatizada e quantificação sinal fluorescente.
Compósitos odontológicos vêm em estreito contacto com os tecidos orais, especialmente células gengivais e pulpares. Fibroblastos seria o alvo dos componentes liberados a partir destes compósitos restauradores 40-41. Além disso, vários estudos têm relatado que as células imortalizadas e células primárias podem ter diferentes respostas celulares em contato com biomateriais. As células primárias foram encontrados para ser mais apropriado para avaliar os efeitos biomateriais 42. Isto explica o uso de células de fibroblastos gengivais humanos primários como modelo para a avaliação da citotoxicidade celular do compósito dentário testado no presente estudo. O potencial de toxicidade das substâncias liberadas de compósito dental tem sido amplamente estudada 43-44. A fim de avaliar tele potencial citotóxico de materiais, duas células modelo de contacto pode ser realizado. No sistema modelo de contacto directo do material é directamente colocado com células-alvo, enquanto no sistema de contacto indirecto, as células alvo estão em contacto com elui a partir de meios biológicos. Em aplicações clínicas e de procedimentos restauradores, composto dental são colocados em contato indireto com os tecidos gengivais. Por este motivo, o protocolo experimental corrente foi focada no sistema de contacto indirecto com fibroblastos gengivais humanos (células na presença dos compostos testados extractos). Como relatado anteriormente por Dahl e colaboradores, as respostas de citotoxicidade foram classificados como graves (<30%), moderado (30-60%), ligeiro (60-90%) ou não-citotóxico (> 90%) com base na actividade relativa aos Os valores obtidos para os controles 45. Portanto, de acordo com este ranking, e à luz dos resultados obtidos (Tabela 1), composto ELS extra baixa retração poderia ser classificado como very ligeiramente citotóxico e apresentaram comportamento comparável às células de controlo durante todo o período do lapso de tempo. Usando o mesmo método de investigação precisamente, os resultados deste estudo podem ser comparados com os de um estudo recentemente publicado. O ELS adicional composta baixo encolhimento demonstraram biocompatibilidade superior em comparação com os dois compostos testados previamente utilizados para a mesma aplicação clínica, que é a restauração direta 11. Mais estudos ainda são necessários para estabelecer a comparação mais completa.
Ao decidir qual ensaio de citotoxicidade para aprovar uma avaliação terminal específico, é importante entender as vantagens e as limitações de cada ensaio. A principal finalidade da imagem confocal é alcançar uma arquitectura 3-D de células e órgãos. A técnica é capaz de revelar não só a superfície de um espécime, mas também a sua subsuperficial. O protocolo aqui descrito sublinha a utilização de MCVL 3D lapso de tempo de imagiologia confocal, como um sensitiva método para avaliar o comportamento de biocompatibilidade in vitro de um compósito dentário. No entanto, a fim de evitar as limitações encontradas neste trabalho, estações de trabalho de anti-vibração podia ser utilizado, a fim de permitir mais estável e mais longo lapso de tempo de imagem; o tampo da mesa pode isolar o sistema confocal usado contra os efeitos prejudiciais que as vibrações no laboratório pode causar. Além disso, os materiais a serem utilizados na cavidade oral, devem, idealmente, ser inofensivo para os tecidos gengivais e não deve conter substâncias que poderiam causar toxicidade sistémica. Em conformidade com a metodologia utilizada e os resultados obtidos a partir do estudo de corrente pode concluir-se que o composto testado (ELS extra de baixo encolhimento) não é citotóxico nas presentes condições experimentais. Como o método CLSM pode dar sensivelmente a taxa inicial de células viáveis, outras possibilidades poderia ser prevista para avaliar mais pontos finais. Em particular, como tem sido relatado recentemente que os monómeros compostos afectam células thrOugh espécies reativas de oxigênio (ROS) 46- 48, é necessária uma investigação mais aprofundada para avaliar se algum correlações entre a citotoxicidade sinalização redes e produção de ROS. O protocolo de futuro poderia ser projetado para avaliar simultaneamente a produção de ROS (H 2 O 2 e / ou O 2 – coloração) e taxa de citotoxicidade (coloração Live / morto) usando lapso de tempo MCVL imagem.
The authors have nothing to disclose.
Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.
Olympus Fluoview FV10i | Olympus | Confocal microscope | |
O2/Co2 Incubator | Pnasonic | MCO 5M | Cell incubation |
Live/Dead® Kit | Invitrogen | MP 03224 | Stain |
ELS extra low shrinkage® | Saremco | Dental composite | |
DMEM medium | Sigma | D 6046 | Culture medium |
Trypsin | Sigma | T1426 | harvesting cells |
chamber slide system | PAA | 14220040X | Culture chamber |
penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | Cell culture |
Amphotericin B | PAA | P11-001 | Cell culture |
Foetal bovine serum | PAA | A11-101 | Cell culture |
Cell Counter | Merck Millipore | 00110230TP1 | Cell counting |